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hflf金蟲 (小有名氣)
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[交流]
【求助/交流】求教蛋白高手 已有3人參與
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這幾天在擺弄全抗表達，由于沒有經(jīng)驗第一次表達時，做的SDS-PAGE膠并且用的也是變性的上樣緩沖液，煮過之后上樣SDS-PAGE電泳并western blot檢測，結(jié)果只顯示了重鏈大小的條帶，師兄們說是變性使輕重鏈解開了，這個抗體只檢測到重鏈沒有檢測到輕鏈，應(yīng)該跑非變性膠，所有的緩沖液都是不能加SDS和巰基乙醇。 按照師兄的提示做了非變性電泳及檢測并用上次的樣做了對照，可是結(jié)果挺奇怪了，貌似全抗大小的片段出現(xiàn)了，而上次的對照卻沒有條帶出現(xiàn)。 高手幫忙解釋一下，還有個問題求教：我有輕重鏈DNA知道其序列，分別克隆到載體上表達后形成全抗，怎么計算其全抗的大小及其pI |
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還想請教一下，全抗是由兩條輕鏈和兩條重鏈組成的，我的重輕鏈是在兩個不同的載體上表達的，共轉(zhuǎn)染細胞，表達后形成全抗，那我就單純地把重鏈和輕鏈的分子量/pI加和么，還是有什么具體的公式么？ 分子量和等電點單純的加和都是不準確的。 抗體輕重鏈之間有二硫鍵連接，不加還原劑的情況下單純的sds不能打開（我是這樣認為的）這樣在進行SDS-PAGE的時候蛋白的空間結(jié)構(gòu)會影響表觀的分子量，你無法判斷。 如果進行native電泳，除非你有已知分子量的蛋白作為marker，否則很難去判斷大小。 pI的確定一般對于單個蛋白的預(yù)測相對準確一些，對于復(fù)合物的預(yù)測不太靠譜，只能參考一下吧。想要精確的需要等點聚焦。 沒有pI你還想做native電泳就多看看文獻，了解一下類似蛋白的pI，然后確定使用酸性native還是堿性native。 |
7樓2010-10-19 10:33:59
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