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hflf金蟲(chóng) (小有名氣)
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【求助/交流】求教蛋白高手 已有3人參與
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這幾天在擺弄全抗表達(dá)，由于沒(méi)有經(jīng)驗(yàn)第一次表達(dá)時(shí)，做的SDS-PAGE膠并且用的也是變性的上樣緩沖液，煮過(guò)之后上樣SDS-PAGE電泳并western blot檢測(cè)，結(jié)果只顯示了重鏈大小的條帶，師兄們說(shuō)是變性使輕重鏈解開(kāi)了，這個(gè)抗體只檢測(cè)到重鏈沒(méi)有檢測(cè)到輕鏈，應(yīng)該跑非變性膠，所有的緩沖液都是不能加SDS和巰基乙醇。 按照師兄的提示做了非變性電泳及檢測(cè)并用上次的樣做了對(duì)照，可是結(jié)果挺奇怪了，貌似全抗大小的片段出現(xiàn)了，而上次的對(duì)照卻沒(méi)有條帶出現(xiàn)。 高手幫忙解釋一下，還有個(gè)問(wèn)題求教：我有輕重鏈DNA知道其序列，分別克隆到載體上表達(dá)后形成全抗，怎么計(jì)算其全抗的大小及其pI |
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4樓2010-10-18 18:59:48
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5樓2010-10-18 20:44:48
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6樓2010-10-18 21:23:21
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還想請(qǐng)教一下，全抗是由兩條輕鏈和兩條重鏈組成的，我的重輕鏈?zhǔn)窃趦蓚�(gè)不同的載體上表達(dá)的，共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，表達(dá)后形成全抗，那我就單純地把重鏈和輕鏈的分子量/pI加和么，還是有什么具體的公式么？ 分子量和等電點(diǎn)單純的加和都是不準(zhǔn)確的。 抗體輕重鏈之間有二硫鍵連接，不加還原劑的情況下單純的sds不能打開(kāi)（我是這樣認(rèn)為的）這樣在進(jìn)行SDS-PAGE的時(shí)候蛋白的空間結(jié)構(gòu)會(huì)影響表觀的分子量，你無(wú)法判斷。 如果進(jìn)行native電泳，除非你有已知分子量的蛋白作為marker，否則很難去判斷大小。 pI的確定一般對(duì)于單個(gè)蛋白的預(yù)測(cè)相對(duì)準(zhǔn)確一些，對(duì)于復(fù)合物的預(yù)測(cè)不太靠譜，只能參考一下吧。想要精確的需要等點(diǎn)聚焦。 沒(méi)有pI你還想做native電泳就多看看文獻(xiàn)，了解一下類(lèi)似蛋白的pI，然后確定使用酸性native還是堿性native。 |
7樓2010-10-19 10:33:59
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