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kukuamu銅蟲 (初入文壇)
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[交流]
【求助】求助高人關(guān)于體內(nèi)藥分萃取回收RSD的問題
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| 想請(qǐng)問下體內(nèi)生物樣本分析，萃取回收率的RSD值有何具體的要求。能找到權(quán)威出處的最好！謝謝大家！ |
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人體生物等效性試驗(yàn)中生物樣本分析技術(shù)的評(píng)價(jià) CDE審評(píng)五部 吳麗花 楊煥 摘要: 筆者通過仔細(xì)分析和梳理在人體生物等效性試驗(yàn)審評(píng)中發(fā)現(xiàn)的生物樣本分析方面的問題,對(duì)《化學(xué)制劑人體生物利用度和生物等效性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》進(jìn)行再次解讀，期望對(duì)進(jìn)一步提高人體生物等效性試驗(yàn)水平有所幫助。 一個(gè)完整的生物等效性研究包括試驗(yàn)設(shè)計(jì)、生物樣本分析、統(tǒng)計(jì)分析和結(jié)果評(píng)價(jià)四方面的內(nèi)容。建立可靠的和可重現(xiàn)的定量分析方法是進(jìn)行生物等效性試驗(yàn)的關(guān)鍵和基礎(chǔ)。2005年SFDA發(fā)布的《化學(xué)制劑人體生物利用度和生物等效性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》中明確地描述了測(cè)定方法建立和確證、質(zhì)量控制的基本要求，此類試驗(yàn)一般都應(yīng)按照該指導(dǎo)原則來進(jìn)行。然而，在審評(píng)過程中發(fā)現(xiàn)部分申請(qǐng)人提供的生物樣本分析資料簡(jiǎn)單且粗糙，嚴(yán)重影響了對(duì)生物等效性試驗(yàn)結(jié)果的整體正確評(píng)價(jià)。本文僅就生物樣本分析技術(shù)評(píng)價(jià)中的常見問題逐一梳理，以供交流。 1．特異性：須提供色譜條件、質(zhì)譜條件、質(zhì)譜掃描圖。應(yīng)該完整提供：（1）空白生物樣品色譜圖：至少要考察6個(gè)不同個(gè)體，空白生物樣品中干擾物質(zhì)的響應(yīng)不超過待測(cè)物定量下限時(shí)響應(yīng)的20%（S/N=5）；（2）對(duì)照物質(zhì)色譜圖（注明濃度）：受試藥品的原形藥物或特定活性代謝物、內(nèi)標(biāo)；（3）空白生物樣品外加對(duì)照物質(zhì)色譜圖（注明濃度）；（4）用藥后的生物樣品色譜圖；（5）對(duì)于質(zhì)譜分析，應(yīng)注意考察分析過程中的基質(zhì)效應(yīng)（ME，將另文詳述）。 2.標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量范圍：反映濃度與儀器響應(yīng)值（峰高、峰面積）之間的關(guān)系，應(yīng)提供線性方程和相關(guān)系數(shù)。需注意：（1）采用與分析樣本相同的生物介質(zhì)（血清、血漿、全血、尿等）；（2）必須至少用6個(gè)濃度點(diǎn)；（3）隨行空白生物樣品（計(jì)算時(shí)不包括該點(diǎn)，僅用于評(píng)價(jià)干擾）；（4）定量范圍要能覆蓋全部待測(cè)生物樣品濃度，不得外推。有文獻(xiàn)資料認(rèn)為上限可為最高濃度的115%，下限可為最低濃度的80%。 多數(shù)申請(qǐng)人在項(xiàng)目上基本都能提供上述資料，但審評(píng)也發(fā)現(xiàn)，盡管試驗(yàn)報(bào)告均提供了線性方程和相關(guān)系數(shù)，大多數(shù)也提供了相應(yīng)濃度的響應(yīng)值，但是往往都忽視了對(duì)合格標(biāo)準(zhǔn)曲線的判定。事實(shí)上，指導(dǎo)原則中清楚地闡述只有合格的標(biāo)準(zhǔn)曲線才能對(duì)臨床待測(cè)樣品進(jìn)行定量計(jì)算。合格標(biāo)準(zhǔn)曲線的判定標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)包括：（1）相關(guān)系數(shù)r > 0.99；（2）實(shí)測(cè)值與標(biāo)示值的偏差（相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差，RSD，精密度）最低濃度點(diǎn)小于20%，其他小于15%。需要指出的是，僅相關(guān)系數(shù)r > 0.99并不能保證實(shí)測(cè)值與標(biāo)示值的偏差在可接受的范圍之內(nèi)。 3．定量下限(LLOQ)：LLOQ是標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度點(diǎn)，需符合下列要求：（1）應(yīng)能滿足測(cè)定3～5個(gè)消除半衰期時(shí)樣品中的藥物濃度或能檢測(cè)出Cmax的1/10～1/20的藥物濃度；（2）其響應(yīng)值應(yīng)為空白生物基質(zhì)干擾物響應(yīng)值的5倍以上（S/N≥5）；（3）準(zhǔn)確度應(yīng)在真實(shí)濃度的80%～120%范圍內(nèi)；精密度為RSD小于20%；（4）至少應(yīng)有5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)試結(jié)果證明。 審評(píng)發(fā)現(xiàn)，多數(shù)試驗(yàn)報(bào)告對(duì)LLOQ的描述是一筆帶過，未對(duì)其準(zhǔn)確度和精密度等指標(biāo)進(jìn)行判定，有時(shí)把LLOQ和最低檢測(cè)限混淆。提醒注意的是，由于定量的需要，LLOQ的響應(yīng)值測(cè)定時(shí)至少要保證S/N在5，而最低檢測(cè)限（靈敏度，S/N＝3）只需能檢到該物質(zhì)即可，但不能保證定量的準(zhǔn)確性。盡管在后續(xù)的精密度和準(zhǔn)確度等考察時(shí)，低濃度的質(zhì)控樣品通常也會(huì)選定在LLOQ，但建議在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，隨行制作5個(gè)定量下限樣本，從而獲得定量下限的準(zhǔn)確度和精密度結(jié)果。 4. 精密度和準(zhǔn)確度：用低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品來考察，需關(guān)注：（1）低濃度的選擇應(yīng)在定量下限3倍以內(nèi)（大多會(huì)選定LLOQ），高濃度應(yīng)接近標(biāo)準(zhǔn)曲線的上限；（2）準(zhǔn)確度：實(shí)測(cè)濃度與真實(shí)濃度（標(biāo)示值）的接近程度，用相對(duì)回收率來表示，一般中、高濃度應(yīng)在85％～115％范圍內(nèi)，在LLOQ附近（低濃度）應(yīng)在80％～120％范圍內(nèi)；（3）精密度：相同濃度樣品測(cè)量值的分散程度（偏差），用批內(nèi)和批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(RSD）來考察，一般（中、高濃度）RSD應(yīng)小于15％，在LLOQ附近（低濃度）RSD應(yīng)小于20％；（4）測(cè)定批內(nèi)精密度，每一濃度至少制備并測(cè)定5個(gè)樣品；測(cè)定批間精密度，應(yīng)在不同天連續(xù)制備并測(cè)定，至少有連續(xù)3個(gè)分析批（不少于45個(gè)樣品）。 質(zhì)控樣品的低濃度選擇LLOQ未嘗不可，倘若對(duì)于LLOQ已經(jīng)進(jìn)行了考察，則最好選擇其它濃度，但注意應(yīng)在LLOQ 的3倍以內(nèi)。對(duì)于高濃度質(zhì)控樣品，可選擇上限值或上限值的75～90%，推薦選擇接近Cmax的濃度（參照文獻(xiàn)報(bào)道或預(yù)試驗(yàn)的Cmax值）。在絕大多數(shù)提供的注冊(cè)資料中，質(zhì)控樣品濃度的選擇通常是符合要求的，但往往沒有充分理解批間精密度的具體要求，或同批內(nèi)精密度一樣提供每一濃度的5個(gè)數(shù)據(jù)，或僅提供每一濃度的3 個(gè)數(shù)據(jù)。故需注意在測(cè)定批間精密度時(shí)至少應(yīng)有連續(xù)3個(gè)分析批，不少于45個(gè)樣品的測(cè)定值。還有的資料以待測(cè)樣品分析時(shí)進(jìn)行方法學(xué)質(zhì)量控制中的批內(nèi)、批間精密度來代替方法學(xué)確證中的批內(nèi)、批間精密度，這是非常不妥的做法。應(yīng)該強(qiáng)調(diào)的是，在方法學(xué)尚未確證之前是無法進(jìn)行生物樣品的定量分析測(cè)定的。 5. 樣本穩(wěn)定性：建議根據(jù)具體情況，并參照文獻(xiàn)中關(guān)于分析物穩(wěn)定性的報(bào)道，在結(jié)合各試驗(yàn)環(huán)節(jié)，考察以下三類樣本的穩(wěn)定性，即（1）含藥生物樣品處理和儲(chǔ)存過程中的穩(wěn)定性（室溫/冷藏/避光/冰凍/凍融條件下）；（2）樣品處理后分析物在溶液中（上樣液）的穩(wěn)定性（室溫/冷藏）；（3）儲(chǔ)備液（包括對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)溶液）的穩(wěn)定性。 審評(píng)中發(fā)現(xiàn)該部分資料缺項(xiàng)十分常見，尤其是處理后的待測(cè)樣品（上樣液）以及儲(chǔ)備液的穩(wěn)定性試驗(yàn)資料往往缺如。建議各臨床試驗(yàn)研究單位盡可能規(guī)范地進(jìn)行穩(wěn)定性考察，以保證生物樣本分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。 例如，某藥物提供的藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)：靜脈滴注75mg后Cmax 12.24±2.22 mg/L、AUC 28.98±2.76 mg·h/L，而國(guó)外參考文獻(xiàn)數(shù)據(jù)為口服后吸收迅速，生物利用度90～100%，口服75mg后Cmax最高約0.5mg/L，AUC約2.4 mg·h/L，兩者進(jìn)行對(duì)比分析，相差甚遠(yuǎn)，經(jīng)申報(bào)單位深入分析試驗(yàn)過程，發(fā)現(xiàn)提供的對(duì)照品在運(yùn)輸過程中極不穩(wěn)定，而在試驗(yàn)中又未進(jìn)行穩(wěn)定性考察，在分析方法學(xué)確證上存在較大問題，故改進(jìn)方法重新進(jìn)行了該品種的藥代動(dòng)力學(xué)研究。 6.提取回收率（絕對(duì)回收率）：指樣品提取過程前、后分析物的含量百分比。需注意（1）扣除基質(zhì)效應(yīng)和體積改變；（2）應(yīng)考察低、中、高3個(gè)濃度的提取回收率；（3）其結(jié)果應(yīng)當(dāng)精密和可重現(xiàn)。對(duì)于提取回收率要求的并不是其絕對(duì)值的高低，能達(dá)到檢測(cè)的靈敏度即可，通常在50%以上。但強(qiáng)調(diào)其結(jié)果應(yīng)精密和可重現(xiàn)，這里包含值得商榷的兩層意思：（1）低、中、高3個(gè)濃度各自的提取回收率的精密度要好，可以認(rèn)為要求RSD小于15%；（2）低、中、高3個(gè)濃度之間的提取回收率也應(yīng)相差不大，可以認(rèn)為總體RSD小于15%。申報(bào)資料對(duì)于提取回收率方法的描述不盡相同，此方面問題將另文討論和分析。 7. 測(cè)定方法的質(zhì)量控制：檢測(cè)生物樣本時(shí)，應(yīng)確保（1）每個(gè)分析批應(yīng)隨行建立新的標(biāo)準(zhǔn)曲線；（2）每個(gè)分析批應(yīng)隨行測(cè)定至少各雙樣本的高、中、低三個(gè)濃度的質(zhì)控樣品，并均勻分布在未知樣品測(cè)試的順序中；（3）質(zhì)控樣品數(shù)應(yīng)不少于未知樣品總數(shù)的5%；（4）質(zhì)控樣品測(cè)定結(jié)果的偏差（RSD）一般在中、高濃度應(yīng)小于15％，低濃度應(yīng)小于20％；（5）最多允許1/3 的質(zhì)控樣品結(jié)果超限，但不能出現(xiàn)在同一濃度中。 申報(bào)資料往往會(huì)提到在生物樣本測(cè)試時(shí)遵守隨行質(zhì)量控制的SOP，卻沒有提供方法學(xué)質(zhì)量控制的具體情況，難以認(rèn)可生物樣本檢測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確、可靠和可重現(xiàn)性；有的資料盡管提供了方法學(xué)質(zhì)量控制的情況，但在描述上過于簡(jiǎn)單，多以質(zhì)控樣品測(cè)定的總體均值和標(biāo)準(zhǔn)差來表示，無法了解每個(gè)質(zhì)控樣品結(jié)果超限的情況，應(yīng)建議提供各質(zhì)控樣品的具體測(cè)定值和RSD，從而可以判定所采用測(cè)定方法的質(zhì)量控制情況。還應(yīng)提醒注意質(zhì)控樣品數(shù)應(yīng)不少于未知樣品總數(shù)的5%。 此外，不論是生物等效性研究還是人體藥代動(dòng)力學(xué)研究，指導(dǎo)原則必須要求申報(bào)單位提供20%受試者樣品測(cè)試（包括隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線及質(zhì)控）的色譜圖復(fù)印件。僅從單個(gè)崗位目前申報(bào)的資料分析，至今仍有近一半的資料中（56/118）沒有提供色譜圖，而有的資料盡管提供了20%受試者樣品測(cè)試的色譜圖，但未提供隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線及質(zhì)控的色譜圖。從生物等效性研究的整體評(píng)價(jià)來看，方法學(xué)的確證和質(zhì)量控制無疑是關(guān)鍵的，而提供的臨床試驗(yàn)報(bào)告缺條少項(xiàng)，無法保證數(shù)據(jù)的真實(shí)性和可靠性，此時(shí)通過所提供的色譜圖有助于判斷生物樣本檢測(cè)的質(zhì)量。為提高對(duì)5、6類化藥技術(shù)審評(píng)的質(zhì)量和效率，提醒注冊(cè)申請(qǐng)人、臨床試驗(yàn)單位規(guī)范生物樣本分析過程，并提供準(zhǔn)確、可靠的數(shù)據(jù)及相關(guān)色譜圖資料。 |
2樓2010-10-25 13:52:03
★ ★
kukuamu(金幣+1):謝謝參與
qinhy(金幣+1): O(∩_∩)O謝謝~~ 2011-02-26 10:20:55
kukuamu(金幣+1):謝謝參與
qinhy(金幣+1): O(∩_∩)O謝謝~~ 2011-02-26 10:20:55
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6.提取回收率（絕對(duì)回收率）：指樣品提取過程前、后分析物的含量百分比。需注意（1）扣除基質(zhì)效應(yīng)和體積改變；（2）應(yīng)考察低、中、高3個(gè)濃度的提取回收率；（3）其結(jié)果應(yīng)當(dāng)精密和可重現(xiàn)。對(duì)于提取回收率要求的并不是其絕對(duì)值的高低，能達(dá)到檢測(cè)的靈敏度即可，通常在50%以上。但強(qiáng)調(diào)其結(jié)果應(yīng)精密和可重現(xiàn)，這里包含值得商榷的兩層意思：（1）低、中、高3個(gè)濃度各自的提取回收率的精密度要好，可以認(rèn)為要求RSD小于15%；（2）低、中、高3個(gè)濃度之間的提取回收率也應(yīng)相差不大，可以認(rèn)為總體RSD小于15%。申報(bào)資料對(duì)于提取回收率方法的描述不盡相同，此方面問題將另文討論和分析。 本文來自: 小木蟲論壇 http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=2525323&fpage=1 體內(nèi)提取回收率，藥物和內(nèi)標(biāo)分開做，既 藥物低中高和內(nèi)標(biāo)共6×4×2個(gè) 低中高的提取回收率要基本一致并且＞50%且RSD＜15% |
3樓2010-10-26 22:26:50
sunxiaoyang010
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4樓2010-11-09 22:40:02
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kukuamu(金幣+1):謝謝參與
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5樓2011-02-25 14:16:48
tingzai0116
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6樓2011-02-25 20:10:19
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7樓2011-02-25 22:48:58
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kukuamu(金幣+1): 謝謝參與
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8樓2012-12-09 13:14:57
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kukuamu(金幣+1): 謝謝參與
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9樓2012-12-10 14:41:06
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[考研] 一志愿華南師大 070300（化學(xué)）304分求調(diào)劑 +3 | 0703武芊慧雪304 2026-03-18 | 3/150 |
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[考研] 一志愿重慶大學(xué)085700資源與環(huán)境專碩，總分308求調(diào)劑 +3 | 墨墨漠 2026-03-18 | 3/150 |
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[考研] 求調(diào)劑，一志愿:南京航空航天大學(xué)大學(xué) ，080500材料科學(xué)與工程學(xué)碩，總分289分 +4 | @taotao 2026-03-19 | 4/200 |
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[考研] 中南大學(xué)化學(xué)學(xué)碩337求調(diào)劑 +3 | niko- 2026-03-19 | 6/300 |
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[考研] A區(qū)線材料學(xué)調(diào)劑 +5 | 周周無極 2026-03-20 | 5/250 |
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[考研] 材料學(xué)求調(diào)劑 +4 | Stella_Yao 2026-03-20 | 4/200 |
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[考研] 301求調(diào)劑 +4 | A_JiXing 2026-03-16 | 4/200 |
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[考研]
 11408 一志愿西電，277分求調(diào)劑
+3
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zhouzhen654 2026-03-16 | 3/150 |
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