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kukuamu銅蟲 (初入文壇)
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[交流]
【求助】求助高人關(guān)于體內(nèi)藥分萃取回收RSD的問題
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| 想請問下體內(nèi)生物樣本分析，萃取回收率的RSD值有何具體的要求。能找到權(quán)威出處的最好！謝謝大家！ |
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mrzouhao
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人體生物等效性試驗中生物樣本分析技術(shù)的評價 CDE審評五部 吳麗花 楊煥 摘要: 筆者通過仔細(xì)分析和梳理在人體生物等效性試驗審評中發(fā)現(xiàn)的生物樣本分析方面的問題,對《化學(xué)制劑人體生物利用度和生物等效性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》進(jìn)行再次解讀，期望對進(jìn)一步提高人體生物等效性試驗水平有所幫助。 一個完整的生物等效性研究包括試驗設(shè)計、生物樣本分析、統(tǒng)計分析和結(jié)果評價四方面的內(nèi)容。建立可靠的和可重現(xiàn)的定量分析方法是進(jìn)行生物等效性試驗的關(guān)鍵和基礎(chǔ)。2005年SFDA發(fā)布的《化學(xué)制劑人體生物利用度和生物等效性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》中明確地描述了測定方法建立和確證、質(zhì)量控制的基本要求，此類試驗一般都應(yīng)按照該指導(dǎo)原則來進(jìn)行。然而，在審評過程中發(fā)現(xiàn)部分申請人提供的生物樣本分析資料簡單且粗糙，嚴(yán)重影響了對生物等效性試驗結(jié)果的整體正確評價。本文僅就生物樣本分析技術(shù)評價中的常見問題逐一梳理，以供交流。 1．特異性：須提供色譜條件、質(zhì)譜條件、質(zhì)譜掃描圖。應(yīng)該完整提供：（1）空白生物樣品色譜圖：至少要考察6個不同個體，空白生物樣品中干擾物質(zhì)的響應(yīng)不超過待測物定量下限時響應(yīng)的20%（S/N=5）；（2）對照物質(zhì)色譜圖（注明濃度）：受試藥品的原形藥物或特定活性代謝物、內(nèi)標(biāo)；（3）空白生物樣品外加對照物質(zhì)色譜圖（注明濃度）；（4）用藥后的生物樣品色譜圖；（5）對于質(zhì)譜分析，應(yīng)注意考察分析過程中的基質(zhì)效應(yīng)（ME，將另文詳述）。 2.標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量范圍：反映濃度與儀器響應(yīng)值（峰高、峰面積）之間的關(guān)系，應(yīng)提供線性方程和相關(guān)系數(shù)。需注意：（1）采用與分析樣本相同的生物介質(zhì)（血清、血漿、全血、尿等）；（2）必須至少用6個濃度點；（3）隨行空白生物樣品（計算時不包括該點，僅用于評價干擾）；（4）定量范圍要能覆蓋全部待測生物樣品濃度，不得外推。有文獻(xiàn)資料認(rèn)為上限可為最高濃度的115%，下限可為最低濃度的80%。 多數(shù)申請人在項目上基本都能提供上述資料，但審評也發(fā)現(xiàn)，盡管試驗報告均提供了線性方程和相關(guān)系數(shù)，大多數(shù)也提供了相應(yīng)濃度的響應(yīng)值，但是往往都忽視了對合格標(biāo)準(zhǔn)曲線的判定。事實上，指導(dǎo)原則中清楚地闡述只有合格的標(biāo)準(zhǔn)曲線才能對臨床待測樣品進(jìn)行定量計算。合格標(biāo)準(zhǔn)曲線的判定標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)包括：（1）相關(guān)系數(shù)r > 0.99；（2）實測值與標(biāo)示值的偏差（相對標(biāo)準(zhǔn)差，RSD，精密度）最低濃度點小于20%，其他小于15%。需要指出的是，僅相關(guān)系數(shù)r > 0.99并不能保證實測值與標(biāo)示值的偏差在可接受的范圍之內(nèi)。 3．定量下限(LLOQ)：LLOQ是標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度點，需符合下列要求：（1）應(yīng)能滿足測定3～5個消除半衰期時樣品中的藥物濃度或能檢測出Cmax的1/10～1/20的藥物濃度；（2）其響應(yīng)值應(yīng)為空白生物基質(zhì)干擾物響應(yīng)值的5倍以上（S/N≥5）；（3）準(zhǔn)確度應(yīng)在真實濃度的80%～120%范圍內(nèi)；精密度為RSD小于20%；（4）至少應(yīng)有5個標(biāo)準(zhǔn)樣品測試結(jié)果證明。 審評發(fā)現(xiàn)，多數(shù)試驗報告對LLOQ的描述是一筆帶過，未對其準(zhǔn)確度和精密度等指標(biāo)進(jìn)行判定，有時把LLOQ和最低檢測限混淆。提醒注意的是，由于定量的需要，LLOQ的響應(yīng)值測定時至少要保證S/N在5，而最低檢測限（靈敏度，S/N＝3）只需能檢到該物質(zhì)即可，但不能保證定量的準(zhǔn)確性。盡管在后續(xù)的精密度和準(zhǔn)確度等考察時，低濃度的質(zhì)控樣品通常也會選定在LLOQ，但建議在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時，隨行制作5個定量下限樣本，從而獲得定量下限的準(zhǔn)確度和精密度結(jié)果。 4. 精密度和準(zhǔn)確度：用低、中、高3個濃度的質(zhì)控樣品來考察，需關(guān)注：（1）低濃度的選擇應(yīng)在定量下限3倍以內(nèi)（大多會選定LLOQ），高濃度應(yīng)接近標(biāo)準(zhǔn)曲線的上限；（2）準(zhǔn)確度：實測濃度與真實濃度（標(biāo)示值）的接近程度，用相對回收率來表示，一般中、高濃度應(yīng)在85％～115％范圍內(nèi)，在LLOQ附近（低濃度）應(yīng)在80％～120％范圍內(nèi)；（3）精密度：相同濃度樣品測量值的分散程度（偏差），用批內(nèi)和批間相對標(biāo)準(zhǔn)差(RSD）來考察，一般（中、高濃度）RSD應(yīng)小于15％，在LLOQ附近（低濃度）RSD應(yīng)小于20％；（4）測定批內(nèi)精密度，每一濃度至少制備并測定5個樣品；測定批間精密度，應(yīng)在不同天連續(xù)制備并測定，至少有連續(xù)3個分析批（不少于45個樣品）。 質(zhì)控樣品的低濃度選擇LLOQ未嘗不可，倘若對于LLOQ已經(jīng)進(jìn)行了考察，則最好選擇其它濃度，但注意應(yīng)在LLOQ 的3倍以內(nèi)。對于高濃度質(zhì)控樣品，可選擇上限值或上限值的75～90%，推薦選擇接近Cmax的濃度（參照文獻(xiàn)報道或預(yù)試驗的Cmax值）。在絕大多數(shù)提供的注冊資料中，質(zhì)控樣品濃度的選擇通常是符合要求的，但往往沒有充分理解批間精密度的具體要求，或同批內(nèi)精密度一樣提供每一濃度的5個數(shù)據(jù)，或僅提供每一濃度的3 個數(shù)據(jù)。故需注意在測定批間精密度時至少應(yīng)有連續(xù)3個分析批，不少于45個樣品的測定值。還有的資料以待測樣品分析時進(jìn)行方法學(xué)質(zhì)量控制中的批內(nèi)、批間精密度來代替方法學(xué)確證中的批內(nèi)、批間精密度，這是非常不妥的做法。應(yīng)該強(qiáng)調(diào)的是，在方法學(xué)尚未確證之前是無法進(jìn)行生物樣品的定量分析測定的。 5. 樣本穩(wěn)定性：建議根據(jù)具體情況，并參照文獻(xiàn)中關(guān)于分析物穩(wěn)定性的報道，在結(jié)合各試驗環(huán)節(jié)，考察以下三類樣本的穩(wěn)定性，即（1）含藥生物樣品處理和儲存過程中的穩(wěn)定性（室溫/冷藏/避光/冰凍/凍融條件下）；（2）樣品處理后分析物在溶液中（上樣液）的穩(wěn)定性（室溫/冷藏）；（3）儲備液（包括對照品和內(nèi)標(biāo)溶液）的穩(wěn)定性。 審評中發(fā)現(xiàn)該部分資料缺項十分常見，尤其是處理后的待測樣品（上樣液）以及儲備液的穩(wěn)定性試驗資料往往缺如。建議各臨床試驗研究單位盡可能規(guī)范地進(jìn)行穩(wěn)定性考察，以保證生物樣本分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。 例如，某藥物提供的藥動學(xué)數(shù)據(jù)：靜脈滴注75mg后Cmax 12.24±2.22 mg/L、AUC 28.98±2.76 mg·h/L，而國外參考文獻(xiàn)數(shù)據(jù)為口服后吸收迅速，生物利用度90～100%，口服75mg后Cmax最高約0.5mg/L，AUC約2.4 mg·h/L，兩者進(jìn)行對比分析，相差甚遠(yuǎn)，經(jīng)申報單位深入分析試驗過程，發(fā)現(xiàn)提供的對照品在運(yùn)輸過程中極不穩(wěn)定，而在試驗中又未進(jìn)行穩(wěn)定性考察，在分析方法學(xué)確證上存在較大問題，故改進(jìn)方法重新進(jìn)行了該品種的藥代動力學(xué)研究。 6.提取回收率（絕對回收率）：指樣品提取過程前、后分析物的含量百分比。需注意（1）扣除基質(zhì)效應(yīng)和體積改變；（2）應(yīng)考察低、中、高3個濃度的提取回收率；（3）其結(jié)果應(yīng)當(dāng)精密和可重現(xiàn)。對于提取回收率要求的并不是其絕對值的高低，能達(dá)到檢測的靈敏度即可，通常在50%以上。但強(qiáng)調(diào)其結(jié)果應(yīng)精密和可重現(xiàn)，這里包含值得商榷的兩層意思：（1）低、中、高3個濃度各自的提取回收率的精密度要好，可以認(rèn)為要求RSD小于15%；（2）低、中、高3個濃度之間的提取回收率也應(yīng)相差不大，可以認(rèn)為總體RSD小于15%。申報資料對于提取回收率方法的描述不盡相同，此方面問題將另文討論和分析。 7. 測定方法的質(zhì)量控制：檢測生物樣本時，應(yīng)確保（1）每個分析批應(yīng)隨行建立新的標(biāo)準(zhǔn)曲線；（2）每個分析批應(yīng)隨行測定至少各雙樣本的高、中、低三個濃度的質(zhì)控樣品，并均勻分布在未知樣品測試的順序中；（3）質(zhì)控樣品數(shù)應(yīng)不少于未知樣品總數(shù)的5%；（4）質(zhì)控樣品測定結(jié)果的偏差（RSD）一般在中、高濃度應(yīng)小于15％，低濃度應(yīng)小于20％；（5）最多允許1/3 的質(zhì)控樣品結(jié)果超限，但不能出現(xiàn)在同一濃度中。 申報資料往往會提到在生物樣本測試時遵守隨行質(zhì)量控制的SOP，卻沒有提供方法學(xué)質(zhì)量控制的具體情況，難以認(rèn)可生物樣本檢測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確、可靠和可重現(xiàn)性；有的資料盡管提供了方法學(xué)質(zhì)量控制的情況，但在描述上過于簡單，多以質(zhì)控樣品測定的總體均值和標(biāo)準(zhǔn)差來表示，無法了解每個質(zhì)控樣品結(jié)果超限的情況，應(yīng)建議提供各質(zhì)控樣品的具體測定值和RSD，從而可以判定所采用測定方法的質(zhì)量控制情況。還應(yīng)提醒注意質(zhì)控樣品數(shù)應(yīng)不少于未知樣品總數(shù)的5%。 此外，不論是生物等效性研究還是人體藥代動力學(xué)研究，指導(dǎo)原則必須要求申報單位提供20%受試者樣品測試（包括隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線及質(zhì)控）的色譜圖復(fù)印件。僅從單個崗位目前申報的資料分析，至今仍有近一半的資料中（56/118）沒有提供色譜圖，而有的資料盡管提供了20%受試者樣品測試的色譜圖，但未提供隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線及質(zhì)控的色譜圖。從生物等效性研究的整體評價來看，方法學(xué)的確證和質(zhì)量控制無疑是關(guān)鍵的，而提供的臨床試驗報告缺條少項，無法保證數(shù)據(jù)的真實性和可靠性，此時通過所提供的色譜圖有助于判斷生物樣本檢測的質(zhì)量。為提高對5、6類化藥技術(shù)審評的質(zhì)量和效率，提醒注冊申請人、臨床試驗單位規(guī)范生物樣本分析過程，并提供準(zhǔn)確、可靠的數(shù)據(jù)及相關(guān)色譜圖資料。 |
2樓2010-10-25 13:52:03
★ ★
kukuamu(金幣+1):謝謝參與
qinhy(金幣+1): O(∩_∩)O謝謝~~ 2011-02-26 10:20:55
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qinhy(金幣+1): O(∩_∩)O謝謝~~ 2011-02-26 10:20:55
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6.提取回收率（絕對回收率）：指樣品提取過程前、后分析物的含量百分比。需注意（1）扣除基質(zhì)效應(yīng)和體積改變；（2）應(yīng)考察低、中、高3個濃度的提取回收率；（3）其結(jié)果應(yīng)當(dāng)精密和可重現(xiàn)。對于提取回收率要求的并不是其絕對值的高低，能達(dá)到檢測的靈敏度即可，通常在50%以上。但強(qiáng)調(diào)其結(jié)果應(yīng)精密和可重現(xiàn)，這里包含值得商榷的兩層意思：（1）低、中、高3個濃度各自的提取回收率的精密度要好，可以認(rèn)為要求RSD小于15%；（2）低、中、高3個濃度之間的提取回收率也應(yīng)相差不大，可以認(rèn)為總體RSD小于15%。申報資料對于提取回收率方法的描述不盡相同，此方面問題將另文討論和分析。 本文來自: 小木蟲論壇 http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=2525323&fpage=1 體內(nèi)提取回收率，藥物和內(nèi)標(biāo)分開做，既 藥物低中高和內(nèi)標(biāo)共6×4×2個 低中高的提取回收率要基本一致并且＞50%且RSD＜15% |
3樓2010-10-26 22:26:50
sunxiaoyang010
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4樓2010-11-09 22:40:02
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kukuamu(金幣+1):謝謝參與
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5樓2011-02-25 14:16:48
tingzai0116
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6樓2011-02-25 20:10:19
cpuyxj
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7樓2011-02-25 22:48:58
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8樓2012-12-09 13:14:57
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9樓2012-12-10 14:41:06
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