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wd519wd706銀蟲 (小有名氣)
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[交流]
【求助】求助關(guān)于畢赤酵母電轉(zhuǎn)化的步驟及需要注意的事項，有做過的給個詳細(xì)過程吧，謝
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xiaopeiliang
金蟲 (小有名氣)
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- 專業(yè): 食品科學(xué)基礎(chǔ)
wd519wd706(金幣+15): 2011-04-09 10:29:59
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畢赤酵母的電轉(zhuǎn)已經(jīng)是很成熟的了，但是在實驗的過程中往往是會遇到問題！ GS115菌株于50ml YPD搖到OD600約1.2-1.5，太高影響感受態(tài)效率 (1) 5000RPM離心5min，將離心管倒置在吸水紙上輕輕控幾下，充分棄上清 (2) 加入10ml 冰浴的超純水ddH2O，可在振蕩器上振蕩混勻，可靜置3－5分鐘 (3) 離心，棄上清，再加10ml ddH2O洗一遍 (4) 離心，棄上清，加10ml 冰浴1M Sorbitol洗一遍 (5) 離心，棄上清，菌體置于冰浴中，加入約100－200ul Sorbitol混勻 加入Sorbitol量需自己調(diào)整，這時菌液很濃，只要能夠用200ul黃槍頭吸出來就可以了，一般共有約400－500ul，夠做幾管感受態(tài)了。 (7) 吸取100－150ul感受態(tài)到線性化的DNA中，用槍頭打勻或手指彈勻 靜置5min，于2mm電轉(zhuǎn)化杯中，電擊參數(shù)：1.5KV，25uF，200歐姆（不是400），一般放電時間在4.5-4.9ms之間，小于4說明你的DNA鹽濃度太高 (9) 立即加入1ml Sorbitol，轉(zhuǎn)入10ml 離心管，30度靜置1小時，然后加入1ml YPD，30度，200rpm搖1小時，取50－200ul菌液涂100ul/ml YPDS板 (10) 一般轉(zhuǎn)化效率可以達(dá)到：200個以上轉(zhuǎn)化子每200ul菌液，足夠篩選表達(dá)菌株了。 |
2樓2010-11-23 09:55:29
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