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leeming08金蟲 (小有名氣)
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[交流]
【求助】原料藥酸破壞和堿破壞實驗的兩個個問題
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求助各位蟲友， 酸破壞，我在做酸破壞行實驗的時候遇到個小問題，一般酸破壞實驗的條件是0.1mol/L－1mol/L鹽酸，我用1mol/L鹽酸破壞2h，并沒有多大的影響，如此這般，我下一步應(yīng)該是增大酸的濃度?增大到多少合適？最大能到多少？或者是延長破壞的時間？最長又能到多少？ 堿破壞，堿破壞后在某雜質(zhì)的保留時間附近出現(xiàn)一個肩峰，有沒有必要把這個肩峰分離開？ |
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kaizi0305
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caoyuan521(金幣+2):謝謝參與！ 2010-11-03 21:47:39
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雜質(zhì)檢查分析方法建立過程中破壞性試驗的意義和存在的問題分析 作者 成海平 部門 正文內(nèi)容 審評三部六室 成海平 雜質(zhì)與藥品臨床使用的安全性密切相關(guān)，如果藥品中存在的雜質(zhì)未能通過有效的方法加以檢出、控制，將給臨床安全造成直接或潛在的危害，因此，制訂合理、有效的藥品雜質(zhì)檢測方法控制藥品中的雜質(zhì)是一項非常重要的工作。雜質(zhì)檢測方法的建立基于方法學(xué)研究，主要包括專屬性試驗、檢測限試驗、溶液穩(wěn)定性試驗等內(nèi)容，如果定量檢測雜質(zhì)還需進(jìn)行線性、回收率等試驗，從不同的角度、層面驗證分析方法的可行，從而保證藥品中的雜質(zhì)能夠有效地檢測。破壞性試驗是雜質(zhì)檢測方法建立時驗證專屬性、檢測靈敏度重要試驗內(nèi)容之一。由于破壞性試驗的實驗過程復(fù)雜，分析檢測技術(shù)要求高，在技術(shù)審評過程中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)存在研究過程中不完善、不全面，因此，在此結(jié)合化學(xué)藥物創(chuàng)新藥的審評工作體會，分析如何合理開展破壞性試驗研究。 破壞性試驗，也稱為強(qiáng)制降解試驗（stressing test），它是在人為設(shè)定的特殊條件下，如酸、堿、氧化、高溫、光照等，引起藥物的降解，通過對降解產(chǎn)物的測定，驗證檢測方法的可行性，分析藥物可能的降解途徑和降解機(jī)制。每項破壞性試驗通常包括以下內(nèi)容：酸降解一般采用0.1mol/L－1mol/L鹽酸或硫酸；堿降解采用0.1mol/L－1mol/L的氫氧化鈉溶液；氧化降解采用合適的過氧化氫溶液。以上三種試驗，為了加快反應(yīng)或者提高降解強(qiáng)度，必要時可以加熱或提高濃度；高溫試驗通常溫度高于加速試驗溫度的10℃，如50℃、60℃等，對于原料藥有時需考慮水溶液或混懸液的降解，或者考慮在不同的pH值條件下的降解；光照試驗條件可采用4500LX。破壞性試驗的具體條件，與具體藥物密切相關(guān)，需結(jié)合具體藥物的特點，選擇合適的條件，使藥物有一定量的降解，并對可能的降解途徑和降解機(jī)制進(jìn)行分析，保證實驗的意義。 藥物經(jīng)強(qiáng)力破壞產(chǎn)生的降解產(chǎn)物通常采用色譜法測定，需結(jié)合藥物和可能降解產(chǎn)物的理化性質(zhì)，選擇不同的色譜方法（HPLC、GC、TLC）或檢測器，有時可采用不同分離機(jī)理的色譜系統(tǒng)。下面以HPLC法分析降解產(chǎn)物為例，說明在進(jìn)行破壞性試驗時的關(guān)注點和存在的問題： 1、在選定的破壞條件下，藥物應(yīng)有一定量的降解。 雖然不是每一種破壞性條件都使藥物產(chǎn)生降解產(chǎn)物，但一般情況下，很少有一種化合物對每一種破壞性試驗條件都穩(wěn)定，因此，可以通過試驗，選擇合適的條件，如提高酸、堿、氧化的濃度或者通過加熱等，使藥物降解。 對于采用HPLC法測定降解產(chǎn)物時，以主成分計算，一般降解10％左右。應(yīng)采用有效的方法對降解產(chǎn)物進(jìn)行檢測，關(guān)注測定的回收量，通常應(yīng)達(dá)到90％左右，證明檢測方法的有效性。 對于破壞性試驗時降解量較大的降解產(chǎn)物，建議結(jié)合穩(wěn)定性研究中加速試驗和長期試驗的具體雜質(zhì)數(shù)據(jù)，參考ICH對新原料藥中雜質(zhì)的規(guī)定（每日服用最大劑量不超過2克時，鑒定閾值為0.10％；每日服用最大劑量超過2克時，鑒定閾值為0.05％。），必要時進(jìn)行定性分析，并作為已知雜質(zhì)，根據(jù)安全性數(shù)據(jù)，采用已知雜質(zhì)對照，確定合理的限度，訂入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。不能采用已知雜質(zhì)進(jìn)行對照時，可通過測定降解產(chǎn)物、主成分在測定波長處的吸收系數(shù)，分析兩者的差異。若兩者吸收系數(shù)相差較大時，建議采用響應(yīng)因子校正后進(jìn)行有效控制；如果兩者吸收系數(shù)相差較小，建議采用自身對照法或峰面積歸一化法進(jìn)行有效控制。 藥物進(jìn)行破壞性試驗時通常降解為小分子物質(zhì)，但也有發(fā)生聚合，形成聚合物，如β－內(nèi)酰胺類抗菌藥物，在高溫或高濕時有可能產(chǎn)生聚合物，故應(yīng)采取有效方法進(jìn)行檢測。 在這方面存在的主要問題是：（1）主藥完全降解，無法對降解產(chǎn)物進(jìn)行有效檢測；（2）由于選擇的降解條件強(qiáng)度不夠，使藥物未能降解，而誤認(rèn)為藥物穩(wěn)定；（3）不能選擇合適測定方法，測定降解產(chǎn)物，使主成分降解后測定的回收量偏低；（4）未考慮破壞性試驗時產(chǎn)生的聚合物；（5）選擇的色譜流動相不合適，在圖譜中有干擾峰。 2、分離度與峰純度分析 破壞性試驗產(chǎn)生的降解產(chǎn)物的個數(shù)比較多，采用HPLC法測定時，需考慮主成分與降解產(chǎn)物之間、降解產(chǎn)物相互之間的分離度，保證降解產(chǎn)物峰與主峰、降解產(chǎn)物峰之間有良好的分離度。另外，對于原料藥，分離度符合要求也應(yīng)考慮到主藥與起始原料、各合成中間體是否有良好的分離度；對于制劑，應(yīng)注意輔料、輔料降解產(chǎn)物的干擾。色譜條件的確定通常以最難分離的兩個降解產(chǎn)物或降解產(chǎn)物與主成分之間的分離度符合要求作為依據(jù)之一。鑒于降解產(chǎn)物檢測時對分離度要求高，故推薦色譜分析時采用梯度洗脫，以有效分離降解產(chǎn)物。 與分離度密切相關(guān)的是峰純度分析。檢測峰純度通常采用二級管陣列檢測器或者液質(zhì)連用技術(shù)分析測定各色譜峰的純度，說明在主峰中、各降解產(chǎn)物峰中有沒有包含其它峰。簡單地通過觀察峰形判斷峰的純度沒有說服力。對于創(chuàng)新藥物的破壞性試驗來說，峰純度分析非常重要，一是可以了解降解產(chǎn)物的特性；二是可以有效地檢出和控制雜質(zhì)。存在的主要問題是：（1）主峰上出現(xiàn)明顯的降解產(chǎn)物峰，測定方法不可行；（2）未對峰純度進(jìn)行有效分析，這是一種常見現(xiàn)象，在此情況下無法判斷主峰中是否包含著降解產(chǎn)物峰；（3）對于制劑，未考慮輔料降解對測定結(jié)果的干擾。 3、檢測靈敏度的考慮 對破壞性試驗產(chǎn)生的降解產(chǎn)物，通�？紤]采取改變測定波長，來分析和檢測降解產(chǎn)物峰個數(shù)和含量，確定合理的檢測條件和方法。這也是測定波長確定的重要依據(jù)之一。必要時可采用不同機(jī)理的色譜系統(tǒng)檢測降解產(chǎn)物。原則上講，所選擇的雜質(zhì)檢測方法應(yīng)能測定破壞性試驗中藥物的每個降解產(chǎn)物（而且也考慮到起始原料、每個合成中間體的檢出），從而達(dá)到對降解產(chǎn)物的控制，同時只有這樣，才能保證有合適的回收量。目前在審評中發(fā)現(xiàn)存在的主要問題是僅提供主成分的檢測限，以主成分的檢測限作為測定波長確定的依據(jù)，而忽視對部分降解產(chǎn)物（包括起始原料和中間體）的檢出，最終體現(xiàn)在降解的回收量達(dá)不到一定的要求，僅有藥物降解，沒有降解產(chǎn)物檢出。 充分認(rèn)識破壞性試驗在雜質(zhì)檢測方法建立中的重要意義，建立科學(xué)合理的雜質(zhì)檢測方法，對于保證臨床用藥安全起著重要作用。以上為個人觀點，僅供參考。 |
5樓2010-11-03 13:53:24
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關(guān)于原料藥有關(guān)物質(zhì)檢查方法建立的思考 作者 趙慧玲 部門 審評四部七室 趙慧玲 正文內(nèi)容 【摘要】本文針對審評原料藥有關(guān)物質(zhì)檢查方法中存在的問題，介紹歐洲和英國藥典關(guān)于原料藥已知雜質(zhì)的研究現(xiàn)狀和有關(guān)物質(zhì)方法建立及質(zhì)量控制，以供申請人參考。 【關(guān)鍵詞】有關(guān)物質(zhì)、方法學(xué)、分離度。 筆者審評原料藥有關(guān)物質(zhì)檢查方法中發(fā)現(xiàn)，大多申請人越來越多地認(rèn)識到控制原料藥有關(guān)物質(zhì)的重要性，自行建立方法考察原料藥中存在的有關(guān)物質(zhì)。但在研究中往往片面認(rèn)為樣品通過了破壞性試驗和1％自身對照法后的系統(tǒng)適用性試驗就符合了要求。因此，忽視對主成分中雜質(zhì)產(chǎn)生原因的分析，忽視儀器的檢測靈敏度的分析、忽略色譜柱（柱效）的選擇、流動相及比例的選擇、檢測波長的選擇。忽視主成分和可能產(chǎn)生的雜質(zhì)分離度的問題。 1、原料藥有關(guān)物質(zhì)方法建立應(yīng)關(guān)注的問題： 原料藥中的雜質(zhì)來源于合成的中間體、副產(chǎn)物、以及降解產(chǎn)物，建立方法初期，僅采用破壞性試驗的方法考察降解產(chǎn)物的做法是片面的。由于降解產(chǎn)物的量較小，如果選擇的方法不好，比如，柱效低，波長選擇不合理、流動相及流動相比例不合適，即使有降解產(chǎn)物，也達(dá)不到有效的靈敏度和有效的分離。因此，一個好的分析方法的建立首要問題應(yīng)是圍繞主成分和雜質(zhì)的分離度和檢測波長進(jìn)行。對于生產(chǎn)原料藥的企業(yè)來講，由于可以通過工藝得到中間體、副產(chǎn)物，在方法建立初始，首先應(yīng)該將可能的中間體和副產(chǎn)物作為雜質(zhì)對待，進(jìn)行柱效、流動相及流動相比例、波長和分離度等方法學(xué)的研究。方法建立成熟后，可根據(jù)中間體和副產(chǎn)物的安全性和工藝得到的難易程度決定是否固定為已知雜質(zhì)。如果工藝中難以得到，且比較安全，可考慮采用雜質(zhì)校正因子加上相對保留時間的方法。或采用雜質(zhì)相對保留時間加上自身對照方法。上述三種方法均有好的分離度和響應(yīng)值（靈敏度）作保證。也是研發(fā)和審評中應(yīng)當(dāng)提倡的。 如果原料合成中確實得不到副產(chǎn)物，對于有紫外吸收的樣品可以用二極管陣列檢測器，考察未精制的粗品，并對比已精制過的樣品，確定粗品中各成分的分離度和樣品中可能雜質(zhì)的檢測波長。方法確立后，可采用自身對照方法或面積歸一化法控制雜質(zhì)。對于后一方法，在研發(fā)和審評中應(yīng)當(dāng)慎重選用。 如果證明上述四個方法是比較成熟的方法后，如果再加上破壞性試驗考察降解產(chǎn)物，其方法就更加完整和適用。 2、介紹歐洲和英國藥典控制有關(guān)物質(zhì)關(guān)注的問題 歐洲和英國藥典的原料藥標(biāo)準(zhǔn)后面，大部分都附有可能產(chǎn)生的中間體和副產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，在有關(guān)物質(zhì)質(zhì)量控制中有些采用已知雜質(zhì)的方法；有些采用雜質(zhì)校正因子加上相對保留時間的方法；雜質(zhì)相對保留時間加上自身對照方法和自身對照方法或面積歸一化法。 例如：核黃素磷酸鈉的有關(guān)物質(zhì)檢查就是采用HPLC的已知雜質(zhì)－核黃素、其他雜質(zhì)相對保留時間加上自身對照的方法。 取本品0.1g，用水50ml溶解，并用流動相稀釋至100ml，取該溶液8ml，用流動相稀釋至50ml，作為供試品溶液。另取核黃素對照品60mg，加鹽酸試液1ml溶解，用水稀釋至250ml, 取該溶液4ml，用流動相稀釋至100ml，作為對照品溶液(a)。再另取核黃素磷酸鈉對照品0.1g，用水50ml溶解，并用流動相稀釋至100ml，取該溶液8ml，用流動相稀釋至50ml，作為對照品溶液(b)。 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（填充劑粒度：5μm；柱長：0.25m；內(nèi)徑：4.6mm）；以甲醇－7.35g/L磷酸二氫鉀溶液（150：850）為流動相；檢測波長266nm；流速2ml/分。5－單磷酸核黃素的保留時間為20分鐘；其他相對保留時間：3，4－二磷酸核黃素大約0.2；3，5－二磷酸核黃素大約0.3；4，5－二磷酸核黃素大約0.5；3－單磷酸核黃素大約0.7；4－單磷酸核黃素大約0.9；核黃素大約2。 取對照溶液（a）100μl注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)主峰高度為滿量程的50％；再注入對照溶液（b）100μl，記錄色譜峰直到核黃素的峰面積能被準(zhǔn)確計算，且4－單磷酸核黃素峰與5－單磷酸核黃素峰的分離度應(yīng)不小于1.5。 精密量取供試品溶液、對照溶液（a）和對照溶液（b）各100μl，分別注入液相色譜儀，供試品溶液的色譜圖中，如有與核黃素峰保留時間相應(yīng)的色譜峰，其峰面積不得大于對照溶液（a）主峰面積（6.0％），二磷酸核黃素面積的和不得大于對照溶液（a）主峰面積（6.0％），且均應(yīng)以干燥品計。 3、結(jié)合國內(nèi)研發(fā)核黃素磷酸鈉的狀況提幾點建議 在審評核黃素磷酸鈉原料和注射劑有關(guān)物質(zhì)的過程中發(fā)現(xiàn)，申請人常參照中國藥典收載的核黃素磷酸鈉及注射液標(biāo)準(zhǔn)項目進(jìn)行。忽視了國內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)和國內(nèi)同品種質(zhì)量的調(diào)研，盲目申報。一些資料中單磷酸核黃素的分離度并不好，從圖譜看起來，表面上其質(zhì)量比國外標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)量好，但實際上是單磷酸核黃素等多個組分并未得到有效分離。雖然國外將各單磷酸鹽均看成有效成分，而未作為雜質(zhì)控制，但在方法學(xué)研究中，的確關(guān)注了各單磷酸鹽的分離度，這應(yīng)是方法學(xué)研究的重點。如果建立的方法不能使每一個成分分離，這個方法就不是一個好的方法。 從這個例子分析，審評中不能簡單認(rèn)為雜質(zhì)個數(shù)少了，質(zhì)量就好，雜質(zhì)個數(shù)多了，質(zhì)量就差，一定要結(jié)合分析方法的好壞，經(jīng)過綜合分析判斷后下結(jié)論。否則，容易犯主觀主義和片面主義的錯誤，將由于因分析方法的分離度較差而導(dǎo)致的雜質(zhì)個數(shù)少的藥品誤認(rèn)為質(zhì)量好。其實，藥品中包含著沒有分開的成分，這個成分很可能是最不安全的成分。因此，一個藥品的有關(guān)物質(zhì)方法的評價更應(yīng)重視分離度方法的評價，在分離度合適的情況下，比較檢出雜質(zhì)的個數(shù)才有意義，不能簡單的以檢出雜質(zhì)的個數(shù)多少論質(zhì)量。 對核黃素磷酸鈉，引起重視的應(yīng)是分離度方法的問題，在有了好的分離度方法基礎(chǔ)上，再根據(jù)每一個成分的安全性和生產(chǎn)工藝的成本，考慮對每一個成分的合理控制，這是有關(guān)物質(zhì)研究的重點。在可能的情況下，推薦使用國外藥典標(biāo)準(zhǔn)的有關(guān)物質(zhì)檢查方法和限度。 建議在仿制原料藥時，首先應(yīng)查閱國外藥典同品種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，借鑒國外的有關(guān)物質(zhì)檢查方法和限度，減少建立方法學(xué)和質(zhì)量研究工作的盲目性。在未有文獻(xiàn)可借鑒時，根據(jù)我國實際的研究水平，建立有關(guān)物質(zhì)的檢查方法。 其二，由于國內(nèi)仿制的原料藥是可以豁免臨床研究的，不同的合成工藝對主藥的影響不同，而可能的中間體、副產(chǎn)物、降解產(chǎn)物會不同。有關(guān)物質(zhì)方法的確定一定要以工藝中的理論上的各成分的分離度為依據(jù)，并與已上市藥品進(jìn)行質(zhì)量對比，確定可能的已知雜質(zhì)或雜質(zhì)相對保留時間保證方法的分離度。 其三，關(guān)注工藝雜質(zhì)并兼顧原料藥的降解產(chǎn)物的安全劑量，其限度可以以已上市藥品的對照數(shù)據(jù)為依據(jù)。 原料藥有關(guān)物質(zhì)的控制方法對質(zhì)量控制來說至關(guān)重要，它是衡量質(zhì)量和穩(wěn)定性一致性的尺子。因此，不能忽視有關(guān)物質(zhì)檢查方法的驗證或方法建立。 上面是以審評核黃素磷酸鈉原料和注射劑有關(guān)物質(zhì)方法為例，說明方法建立應(yīng)關(guān)注的重點問題是分離度，沒有分離度作保證，方法的根基就不牢固。希望能對申請人的研發(fā)起到幫助，并減少申報資料的發(fā)補(bǔ)率。 |
6樓2010-11-03 14:00:16
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2樓2010-10-28 14:34:03
3樓2010-10-28 14:36:37
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4樓2010-11-03 13:41:11
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7樓2010-11-03 15:42:54
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10樓2010-12-22 16:55:28
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