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chendarid0銀蟲 (初入文壇)
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[交流]
【求助/交流】關(guān)于熒光定量PCR中cdna合成的問題 已有7人參與
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各位高手請指點啊 ，小弟在此謝過了 我是做熒光定量pcr的 在其上游步驟cdna合成中 我用primescript 1st strand cdna synthesis kit 時得到的cdna用內(nèi)參引物β-actin進(jìn)行半定量pcr鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)目的條帶比較淡，但無其他雜帶。但是我用他們公司推薦的專門用于熒光定量pcr的可以去除基因組dna污染的試劑盒primescript RT reagent kit with gDNA eraser時可以得到目的條帶比較亮，但是卻有小于100bp的引物二聚體，呈彌散霧狀分布在下方，聽師姐說cdna合成后是需要基因組dna的去除的，請問各位高手這是怎么回事 謝謝 |
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chendarid0
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silicare(金幣+1):謝謝參與 2010-11-04 11:57:21
silicare(金幣+1):謝謝參與 2010-11-04 11:57:21
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1、嚴(yán)格的提取RNA是最關(guān)鍵的一步，如果有條件就上Qiagen的盒子或者用Trizol等自己按照方法提取。 2、良好的總RNA，如果需要，可以純化，獲取mRNA，純化的柱子好壞有差異，一般一分錢一分貨。 3、可參考一下 fermentas的revert Aid系列的反轉(zhuǎn)錄酶，選擇適合你的種類。 4、反轉(zhuǎn)錄后的效率測定，一定注意嚴(yán)格定量哦！引物的合成，請采用色譜級別。稀釋時注意均勻。 5、實時定量的反應(yīng)條件確定嗎？管子等都得考慮上乘的質(zhì)量哈。 |
7樓2010-11-04 11:19:06
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我有這試劑盒 但有問題
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我有這種可以去除基因組DNA的primerscript RT reagent kit with gDNA eraser(perfect real time)的專門為熒光定量的試劑盒，可是得到的CDNA進(jìn)行以內(nèi)參基因β-actin為引物pcr擴(kuò)增時出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。以前用那種不含基因組DNA去除的普通試劑盒primerscript 1st strand cdna synthesis kit 時反而沒有非特異性擴(kuò)增，這是怎么回事呢？ 我是想用去除基因組DNA的primerscript RT reagent kit with gDNA eraser(perfect real time)的專門為熒光定量的試劑盒，怎樣才能避免非特異性擴(kuò)增呢？ 非特異性擴(kuò)增一般在目的條帶下面呈霧狀團(tuán)簇狀分布，有點像云朵，也有小于100bp的引物二聚體。 請各位高手指點一二，小弟不勝感激! |
8樓2010-11-05 09:51:02
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9樓2010-11-05 09:52:21
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10樓2010-11-05 09:53:35
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