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D調(diào)華麗木蟲 (正式寫手)
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【求助/交流】（引物設(shè)計(jì)）怎么防止pET28a中Nco1的ATG影響目的基因的表達(dá)？ 已有1人參與
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我想在目的基因上游加NcoI酶切位點(diǎn)（C/CATGG），把目的基因連到pET28a上。 因?yàn)槟康幕蜃陨硪灿蠥TG，而用NcoI酶切后與pET28a連接上后NcoI也會(huì)剩一個(gè)ATG，所以目的基因前面也有個(gè)ATG了， 翻譯應(yīng)該是從NcoI酶切剩下的ATG開(kāi)始的吧， 如果在目的基因上ATG翻譯之前，先終止一次的話，后面的目的基因還可以繼續(xù)翻譯嗎？ 或者還有其他方法 讓pET28a中Nco1酶切后剩的ATG不影響目的基因的表達(dá)？ 請(qǐng)相關(guān)人才指點(diǎn)一下哈！ 謝謝！ [ Last edited by D調(diào)華麗 on 2010-10-31 at 14:06 ] |
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沒(méi)聽(tīng)明白你問(wèn)的問(wèn)題。 NcoI(CCATGG)里的atg是緊跟在pET28a里的T7 promoter 之后，其后的DNA序列將被轉(zhuǎn)錄并試圖在核糖體上翻譯為蛋白。你的目的基因一般也是以atg開(kāi)始的，如果直接按照其后密碼子的序列加上去的話一般要在Met之后和你的蛋白直接多插入一個(gè)氨基酸。這一般對(duì)蛋白的表達(dá)和特性影響不大。 如果你的蛋白第二個(gè)氨基酸codon剛好可以是g開(kāi)頭（Val，Ala，Asp 或者 Glu）的話，恭喜你，你可以把第二個(gè)codon整合到NcoI里頭，從而無(wú)差別的表達(dá)蛋白序列。 反正注意從NcoI里頭的ATG開(kāi)始，能夠按幀翻譯你的蛋白就行，N端的幾個(gè)氨基酸差別應(yīng)該不至于影響你的基因表達(dá)。 |
3樓2010-10-31 08:03:34
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我想在目的基因上游加NcoI酶切位點(diǎn)（C/CATGG），把目的基因連到pET28a上。 因?yàn)槟康幕蜃陨硪灿蠥TG，而用NcoI酶切后與pET28a連接上后NcoI也會(huì)剩一個(gè)ATG，所以目的基因前面也有個(gè)ATG了， 翻譯應(yīng)該是從NcoI酶切剩下的ATG開(kāi)始的吧， 目的蛋白前面連了幾個(gè)雜蛋白會(huì)影響目的蛋白的活性的吧？ 如果在目的基因上ATG翻譯之前，先終止一次的話，后面的目的基因還可以繼續(xù)翻譯嗎？ 或者還有其他方法 讓pET28a中Nco1酶切后剩的ATG不影響目的基因的表達(dá)？ 謝謝！ |
5樓2010-10-31 12:06:21
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10樓2011-12-27 20:00:33
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