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方亞楠新蟲(chóng) (初入文壇)
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[交流]
【求助/交流】Fosmid文庫(kù)雙酶切切不開(kāi)！急求 已有2人參與
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我今天做Fosmid克隆的雙酶切，用的是EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ的雙酶切，載體大小為8100bp，我的目的片段是35Kb，參考的文獻(xiàn)上是用這兩種酶切的，而且能切開(kāi)，我的結(jié)果沒(méi)有切開(kāi)，跑的普通瓊脂糖電泳，23Kb的marker都已經(jīng)跑開(kāi)了，但是Fosmid沒(méi)有切開(kāi)，在點(diǎn)樣孔附近有一大團(tuán)。好奇怪，為什么沒(méi)切開(kāi)呢，我的酶量各加了1u，同時(shí)怕酶濃度太大，所以又做了酶量為0.5ul的，可是都沒(méi)有切開(kāi)。不知道哪里出問(wèn)題了，有做過(guò)Fosmid克隆酶切的嗎？急求原因了，我在想是不是有必要跑脈沖場(chǎng)電泳來(lái)檢測(cè)��？還是換用Not Ⅰ進(jìn)行酶切呢？ 非常感謝大家，這是我實(shí)驗(yàn)的最后一步了，如果這步做完了就基本上畢業(yè)了，謝謝大家了  |
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brightfuture01
木蟲(chóng)之王 (文壇精英)
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scelab(金幣+10):熱心蟲(chóng)友，歡迎多來(lái)交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-11-08 23:10:35
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scelab(金幣+10):熱心蟲(chóng)友，歡迎多來(lái)交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-11-08 23:10:35
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我初步分析一下： 你的凝膠濃度應(yīng)該跑0.8%或者更低的； 如果你的23kb 的 lamda DNA marker都已經(jīng)分開(kāi)的話，那么你的質(zhì)粒不應(yīng)該集中在 點(diǎn)樣孔附近，因?yàn)槿绻鞘俏疵盖虚_(kāi)的質(zhì)粒的話道理上來(lái)講應(yīng)該跑出孔去的； 你在說(shuō)你的酶量的時(shí)候并未說(shuō)你的酶切體系大小； 我的一點(diǎn)懷疑及一點(diǎn)建議： 我懷疑你的粘粒DNA沒(méi)有提取好，里面含雜質(zhì)較多，要么是蛋白質(zhì)，要么是基因組DNA； 我的建議是，你雙酶切切不開(kāi)，你做單酶切了么？比如你用EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ的單酶切作為雙酶切的對(duì)照，如果兩個(gè)單酶切都能切開(kāi)，這能說(shuō)明什么？如果兩個(gè)單酶切都切不開(kāi)或者只有一個(gè)能切開(kāi)，這又說(shuō)明什么? 呵呵，實(shí)驗(yàn)做不出來(lái)的時(shí)候，再次重復(fù)的時(shí)候一定要做對(duì)照，否則盲目重復(fù)沒(méi)有任何意義。 祝好運(yùn) |
2樓2010-11-08 22:47:07
方亞楠
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3樓2010-11-09 08:21:56
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