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方亞楠新蟲 (初入文壇)
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[交流]
【求助/交流】Fosmid文庫雙酶切切不開！急求 已有2人參與
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我今天做Fosmid克隆的雙酶切，用的是EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ的雙酶切，載體大小為8100bp，我的目的片段是35Kb，參考的文獻上是用這兩種酶切的，而且能切開，我的結(jié)果沒有切開，跑的普通瓊脂糖電泳，23Kb的marker都已經(jīng)跑開了，但是Fosmid沒有切開，在點樣孔附近有一大團。好奇怪，為什么沒切開呢，我的酶量各加了1u，同時怕酶濃度太大，所以又做了酶量為0.5ul的，可是都沒有切開。不知道哪里出問題了，有做過Fosmid克隆酶切的嗎？急求原因了，我在想是不是有必要跑脈沖場電泳來檢測啊？還是換用Not Ⅰ進行酶切呢？ 非常感謝大家，這是我實驗的最后一步了，如果這步做完了就基本上畢業(yè)了，謝謝大家了  |
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brightfuture01
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scelab(金幣+10):熱心蟲友，歡迎多來交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-11-08 23:10:35
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我初步分析一下： 你的凝膠濃度應(yīng)該跑0.8%或者更低的； 如果你的23kb 的 lamda DNA marker都已經(jīng)分開的話，那么你的質(zhì)粒不應(yīng)該集中在 點樣孔附近，因為如果那是未酶切開的質(zhì)粒的話道理上來講應(yīng)該跑出孔去的； 你在說你的酶量的時候并未說你的酶切體系大小； 我的一點懷疑及一點建議： 我懷疑你的粘粒DNA沒有提取好，里面含雜質(zhì)較多，要么是蛋白質(zhì)，要么是基因組DNA； 我的建議是，你雙酶切切不開，你做單酶切了么？比如你用EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ的單酶切作為雙酶切的對照，如果兩個單酶切都能切開，這能說明什么？如果兩個單酶切都切不開或者只有一個能切開，這又說明什么? 呵呵，實驗做不出來的時候，再次重復(fù)的時候一定要做對照，否則盲目重復(fù)沒有任何意義。 祝好運 |
2樓2010-11-08 22:47:07
方亞楠
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3樓2010-11-09 08:21:56
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