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北京石油化工學(xué)院2026年研究生招生接收調(diào)劑公告
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shyuyafeng

木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)

[交流] 【求助/交流】SDS-PAGE電泳問(wèn)題

我跑的樣品是蛋白，最近跑電泳的時(shí)候，樣品剛進(jìn)入分離膠的時(shí)候成線狀，但是過(guò)了一會(huì)就開(kāi)始彌散，昨天今天都是這樣，昨天濃縮膠是80v，分離膠是100v，昨天晚上看了點(diǎn)資料別人說(shuō)可能是電壓的問(wèn)題，今天把分離膠的電壓降低了還是彌散。分離膠和濃縮膠的pH沒(méi)有問(wèn)題，電泳液也是新配的，
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shyuyafeng

木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
rainwander:找到原因就好。我做的時(shí)候都是混合加熱8-15分鐘，跑之前離心1min，跑完之后染色，沒(méi)問(wèn)題。 2010-12-12 16:33:12
引用回帖:
Originally posted by piaopiao233 at 2010-11-16 17:16:19:
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)問(wèn)題了，是什么原因呢？讓大家都借鑒一下啊

恩，我覺(jué)得主要的問(wèn)題是，我的樣品和buffer融合之后加熱到100度這個(gè)時(shí)間有點(diǎn)短，平時(shí)都是3min中，這次我延長(zhǎng)到了8分鐘，這樣使蛋白質(zhì)和SDS充分結(jié)合，然后在上樣之前我又離心了一遍，2min，最后跑的條帶就很好，基本上沒(méi)有彌散和拖尾了。
19樓2010-11-16 21:09:03
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chemifunan

木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
★ ★
小木蟲(chóng)(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖交流
lstt09nk(金幣+1):感謝交流 2010-11-17 11:11:57
哦 對(duì)的 上樣前是要離心 忘了說(shuō)了

上次是說(shuō) 裝溴酚蘭母液的瓶子也會(huì)沉淀 就是在往蛋白里加之前 煮之前的時(shí)候 裝溴酚蘭變性液 也離一下 取上層的加到蛋白樣品里 5* stock就是1:4 不要太多 然后沸水浴8分鐘 (過(guò)長(zhǎng)會(huì)斷掉一些蛋白 10min內(nèi)不會(huì) 但是樓主你3min是短了 前沿彌散可能和溴酚蘭過(guò)量有關(guān)系) 再離心 12000rpm 1min 取上清PAGE 就可以了
25樓2010-11-17 09:25:07
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普通回帖

375433261

新蟲(chóng) (小有名氣)
★ ★
shyuyafeng(金幣+1):謝謝參與
lstt09nk(金幣+1):鼓勵(lì)交流 2010-11-13 16:03:39
應(yīng)該不是電壓的問(wèn)題，我就是用這樣的電壓跑的 ，跑出的條帶挺好的，應(yīng)該是你的樣品濃度太高了，或者是分離膠的配方有問(wèn)題 電壓肯定是沒(méi)問(wèn)題的
2樓2010-11-13 15:59:37
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hwamg

銀蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
★
shyuyafeng(金幣+1):謝謝參與
彌撒是不是你的交聯(lián)劑temed有問(wèn)題或配比當(dāng)啊 電壓我們濃縮80v  分離膠120v
3樓2010-11-13 16:36:06
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shyuyafeng

木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
★ ★
scelab:編輯內(nèi)容 2010-11-13 18:49
scelab:我?guī)湍銈髁松蟻?lái)~~~ 2010-11-13 18:50:16
silicare(金幣+2):鼓勵(lì)上圖 2010-11-15 17:22:10
內(nèi)容已刪除
4樓2010-11-13 17:40:36
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shyuyafeng

木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
引用回帖:
Originally posted by 375433261 at 2010-11-13 15:59:37:
應(yīng)該不是電壓的問(wèn)題，我就是用這樣的電壓跑的 ，跑出的條帶挺好的，應(yīng)該是你的樣品濃度太高了，或者是分離膠的配方有問(wèn)題 電壓肯定是沒(méi)問(wèn)題的

15%的分離膠 配方是按分子生物手冊(cè)上配的肯定沒(méi)問(wèn)題，樣品濃度高會(huì)導(dǎo)致彌散嗎？
5樓2010-11-13 17:51:23
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shyuyafeng

木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
引用回帖:
Originally posted by hwamg at 2010-11-13 16:36:06:
彌撒是不是你的交聯(lián)劑temed有問(wèn)題或配比當(dāng)啊 電壓我們濃縮80v  分離膠120v

TE是買(mǎi)的現(xiàn)成的，應(yīng)該沒(méi)有問(wèn)題，配比是按分子生物手冊(cè)上配的，沒(méi)有問(wèn)題啊。
6樓2010-11-13 17:53:10
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一夜不留痕

銀蟲(chóng) (初入文壇)
★
shyuyafeng(金幣+1):謝謝參與
兄弟 你跑的是不是tricine膠 也就是三層膠呀  如果是的話 可能是負(fù)極電泳液弄錯(cuò)了  PH出問(wèn)題了或者是沒(méi)有加SDS
7樓2010-11-15 12:49:36
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tianhuijuan

金蟲(chóng) (小有名氣)
★
shyuyafeng(金幣+1):謝謝參與
引用回帖:
Originally posted by shyuyafeng at 2010-11-13 17:51:23:


15%的分離膠 配方是按分子生物手冊(cè)上配的肯定沒(méi)問(wèn)題，樣品濃度高會(huì)導(dǎo)致彌散嗎？

只知道樣品鹽濃度高會(huì)導(dǎo)致電泳條帶彌散。不清楚濃度的影響。
8樓2010-11-15 12:56:29
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wyf10071121

新蟲(chóng) (初入文壇)
★
shyuyafeng(金幣+1):謝謝參與
我試驗(yàn)的時(shí)候也出現(xiàn)了這樣的情況，不過(guò)還好了最后不影響后續(xù)的試驗(yàn)�。�
9樓2010-11-15 13:28:09
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piaopiao233

金蟲(chóng) (小有名氣)
★
shyuyafeng(金幣+1):謝謝參與
是多大的蛋白質(zhì)啊，要用到這個(gè)濃度的膠嗎？
10樓2010-11-15 14:01:36
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shyuyafeng

木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
引用回帖:
Originally posted by piaopiao233 at 2010-11-15 14:01:36:
是多大的蛋白質(zhì)啊，要用到這個(gè)濃度的膠嗎？

分子量大概在20kd-30kd。
11樓2010-11-15 17:07:19
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shyuyafeng

木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
引用回帖:
Originally posted by 一夜不留痕 at 2010-11-15 12:49:36:
兄弟 你跑的是不是tricine膠 也就是三層膠呀  如果是的話 可能是負(fù)極電泳液弄錯(cuò)了  PH出問(wèn)題了或者是沒(méi)有加SDS

不是啊，我的兩層膠，分離膠和濃縮膠~
12樓2010-11-15 17:14:25
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shyuyafeng

木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
引用回帖:
Originally posted by wyf10071121 at 2010-11-15 13:28:09:
我試驗(yàn)的時(shí)候也出現(xiàn)了這樣的情況，不過(guò)還好了最后不影響后續(xù)的試驗(yàn)�。�

那你染色后小分子量的條帶能看清楚嗎？
13樓2010-11-15 17:16:44
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piaopiao233

金蟲(chóng) (小有名氣)
★ ★ ★ ★ ★
scelab(金幣+5):熱心蟲(chóng)友，歡迎多來(lái)交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-11-15 23:08:44
shyuyafeng(金幣+3):謝謝，我已經(jīng)發(fā)現(xiàn)問(wèn)題了。 2010-11-16 16:52:29
你看的時(shí)候不光要看電壓
一般我們是保持電流的恒定，所以有時(shí)候電壓會(huì)上下浮動(dòng)一點(diǎn)，要不然會(huì)跑的很慢之類(lèi)的。
還有你的樣品是怎么制得的？上樣緩沖液有沒(méi)有什么問(wèn)題？你的蛋白marker在電泳過(guò)程中也出現(xiàn)彌散嗎？
建議你先看看樣品，確定沒(méi)什么問(wèn)題再看膠。
以前這個(gè)儀器別人用的時(shí)候有沒(méi)有什么問(wèn)題？換個(gè)濃度試試？換別人的樣試一試？
多試幾次肯定就明白了
14樓2010-11-15 19:15:51
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xqlcjy

銀蟲(chóng) (小有名氣)
★
shyuyafeng(金幣+1):謝謝參與
同意樓上的，還是先看看你的MARKER，如果你的MARKER沒(méi)有問(wèn)題，說(shuō)明你加樣就有問(wèn)題了
15樓2010-11-15 21:58:12
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luohuijun

木蟲(chóng) (小有名氣)
★
shyuyafeng(金幣+1):謝謝參與
看樣子應(yīng)該是樣品量加多了，你減少量，調(diào)一下分離膠與濃縮膠的比例。
16樓2010-11-16 16:51:14
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piaopiao233

金蟲(chóng) (小有名氣)
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)問(wèn)題了，是什么原因呢？讓大家都借鑒一下啊
17樓2010-11-16 17:16:19
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chemifunan

木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
★
shyuyafeng(金幣+1):謝謝參與
shyuyafeng(金幣+4): 2010-11-16 21:09:16
樓主同學(xué) 這個(gè)正常 不算彌散 樣品是否彌散要染色后看你的目標(biāo)條帶的情況才知道 跑的時(shí)候看到的是溴酚蘭 溴酚蘭跑花了不代表?xiàng)l帶跑花 在電泳中 確實(shí)也有溴酚蘭從頭到尾是一條細(xì)線的時(shí)候 （雖然這也不代表你的樣品不彌散 這兩件事不是沒(méi)有關(guān)系 而是沒(méi)有必然的關(guān)系） 畢竟這樣好看一點(diǎn) 我沒(méi)仔細(xì)分析過(guò)這個(gè)原因和技巧 只要染色過(guò)后我要的band清楚就行了

如果各種溶液沒(méi)問(wèn)題的話 那我覺(jué)得和配的溴酚蘭有關(guān) 溴酚蘭不要上太多 母液用之前離心一下 去掉里面的沉淀物 如果還不行 看看換個(gè)電泳槽 不同的電泳槽狀態(tài)不一樣 冒泡的速度都不一樣

但是不影響你看結(jié)果 我覺(jué)得不用搞這么緊張
18樓2010-11-16 19:51:22
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shyuyafeng

木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
引用回帖:
Originally posted by chemifunan at 2010-11-16 19:51:22:
樓主同學(xué) 這個(gè)正常 不算彌散 樣品是否彌散要染色后看你的目標(biāo)條帶的情況才知道 跑的時(shí)候看到的是溴酚蘭 溴酚蘭跑花了不代表?xiàng)l帶跑花 在電泳中 確實(shí)也有溴酚蘭從頭到尾是一條細(xì)線的時(shí)候 （雖然這也不代表你的樣品不 ...

恩，我今天跑的樣就很好，可能就如你說(shuō)的上樣前離心一下效果不錯(cuò)。
20樓2010-11-16 21:11:20
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qutao1720

金蟲(chóng) (小有名氣)
★
shyuyafeng(金幣+1):謝謝參與
可能是樣品里的鹽濃度高啦
21樓2010-11-16 21:31:08
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小周

鐵桿木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
★
shyuyafeng(金幣+1):謝謝參與
你的樣品是什么呀？蛋白是溶解在什么里的？
22樓2010-11-16 22:09:34
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xjyxhyxqh

木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
★
shyuyafeng(金幣+1):謝謝參與
從照片來(lái)看，你跑得沒(méi)有問(wèn)題。下面的那種拖尾，有時(shí)是正常的。你染色后就知道了。
23樓2010-11-16 22:34:10
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xiong86yu

金蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
★
shyuyafeng(金幣+1):謝謝參與
估計(jì)還是濃度問(wèn)題，
24樓2010-11-16 22:36:57
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piaopiao233

金蟲(chóng) (小有名氣)
★
小木蟲(chóng)(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖交流
引用回帖:
Originally posted by shyuyafeng at 2010-11-16 21:11:20:

恩，我今天跑的樣就很好，可能就如你說(shuō)的上樣前離心一下效果不錯(cuò)。

哦這樣啊，我們一般煮5min。而且注意一下，要在水開(kāi)了放進(jìn)去，要不然時(shí)間是不對(duì)的，可能煮了半天還是不開(kāi)的水，不到100℃
26樓2010-11-17 11:12:54
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2009227004

金蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
★
小木蟲(chóng)(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖交流
引用回帖:
Originally posted by shyuyafeng at 2010-11-16 21:09:03:

恩，我覺(jué)得主要的問(wèn)題是，我的樣品和buffer融合之后加熱到100度這個(gè)時(shí)間有點(diǎn)短，平時(shí)都是3min中，這次我延長(zhǎng)到了8分鐘，這樣使蛋白質(zhì)和SDS充分結(jié)合，然后在上樣之前我又離心了一遍，2min，最后跑的條帶就很好， ...

我們一般加熱都是95度10分鐘。。。。
27樓2010-11-17 14:23:24
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2009227004

金蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
其實(shí)散一點(diǎn)也還好，只要跑出來(lái)的蛋白 沒(méi)有什么問(wèn)題就OK了
28樓2010-11-17 14:24:24
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muziyu1024

金蟲(chóng) (小有名氣)
樣品pH的問(wèn)題
29樓2010-12-02 00:13:01
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xuqingchun33

銀蟲(chóng) (小有名氣)
★
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我遇見(jiàn)過(guò)一次，后來(lái)發(fā)現(xiàn)是電流過(guò)大的原因
30樓2010-12-02 08:44:47
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xiaoyu1014126

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★
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應(yīng)該是膠濃度沒(méi)有調(diào)整好，或者是TEMED問(wèn)題，交聯(lián)的不夠好，現(xiàn)在氣溫低，可能有影響，你可以灌好上層膠后放在37℃ 的培養(yǎng)箱里讓之凝固，快而且好
31樓2010-12-02 08:53:32
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jessica533

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silicare(金幣+1):反了電流不通 就下不去了 2010-12-02 12:08:42
你的塑料對(duì)稱板似乎放反了哎
32樓2010-12-02 10:30:39
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jessica533

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我是說(shuō)不加樣品的對(duì)稱板放反了，反了也沒(méi)什么了，并不妨礙電路，只是也許會(huì)漏緩沖液，多加點(diǎn)緩沖液就ok了
33樓2010-12-03 09:13:03
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shyuyafeng

木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
引用回帖:
Originally posted by jessica533 at 2010-12-03 09:13:03:
我是說(shuō)不加樣品的對(duì)稱板放反了，反了也沒(méi)什么了，并不妨礙電路，只是也許會(huì)漏緩沖液，多加點(diǎn)緩沖液就ok了

沒(méi)有放反哦，它本來(lái)就是這樣的，上面也寫(xiě)了這面朝里。
34樓2010-12-03 13:06:45
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茜茜1986

新蟲(chóng) (初入文壇)
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我懷疑和分離膠緩沖液有關(guān) 你看一下你的緩沖液的pH值是否正確，我以前有過(guò)類(lèi)似的經(jīng)歷，發(fā)現(xiàn)是緩沖液的pH值的問(wèn)題，重新配了就好了
35樓2010-12-03 16:29:27
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aersileng

銀蟲(chóng) (初入文壇)
★
小木蟲(chóng)(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖交流
注意下你的loading buffer，有段時(shí)間我的SDS下端不能成線，后面換了loading buffer，解決了
36樓2010-12-12 15:02:28
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shuaisuo1984

鐵蟲(chóng) (初入文壇)
★
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沒(méi)問(wèn)題呢，我的也是彌散的，但是那只是溴酚藍(lán)的彌散，出來(lái)的條帶還是挺好的，主要是控制好樣品濃度。
37樓2010-12-14 11:08:08
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tea_gl9871

銅蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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引用回帖:
19樓: Originally posted by shyuyafeng at 2010-11-16 21:09:03:
恩，我覺(jué)得主要的問(wèn)題是，我的樣品和buffer融合之后加熱到100度這個(gè)時(shí)間有點(diǎn)短，平時(shí)都是3min中，這次我延長(zhǎng)到了8分鐘，這樣使蛋白質(zhì)和SDS充分結(jié)合，然后在上樣之前我又離心了一遍，2min，最后跑的條帶就很好， ...

能不能解釋一下為什么要把樣品和buffer混合后加熱100度8分鐘？
還有你的樣品最終定量到多大濃度？每孔上樣多少？能否把你現(xiàn)在的protocol給我發(fā)一份，我也在做SDS-PAGE。希望得到你的指點(diǎn)，謝謝��！
我的郵箱tea_gl@126.com
38樓2011-12-12 08:58:04
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還好吧DJ

新蟲(chóng) (初入文壇)
★
小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
我今天也遇到了這個(gè)情況，將蛋白稀釋了一下，就好了。看了前輩們的東西，收獲很大��！
39樓2014-10-05 14:32:07
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