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[交流]
【求助】real time PCR 實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)
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| 哪位做過real time PCR��？能把詳細(xì)步驟告訴在嗎？還有注意事項(xiàng)，及自己的心得體會？呵呵，多謝了哈 |
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我的RT-PCR過程
xds手術(shù)刀(金幣+8): 2010-12-11 21:59:59
xds手術(shù)刀(金幣+5): 謝謝啊！ 2011-03-14 12:57:03
xds手術(shù)刀(金幣+5): 謝謝啊！ 2011-03-14 12:57:03
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RNA提取實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備 （1）使用器具：盡量使用一次性塑料器皿，必須使用玻璃器皿時應(yīng)按照下列方法處理。 ①用0.1%的DEPC水溶液在37℃下處理12h。 ②然后在120℃下高壓滅菌30min，以除去殘留的DEPC。 （2）試劑的配制：用于RNA實(shí)驗(yàn)的試劑，需用干熱滅菌（180℃，60min），或使用上述方法進(jìn)行DEPC水處理滅菌后的玻璃容器盛裝，使用的無菌水需用0.1%的DEPC處理后再進(jìn)行高溫高壓滅菌。 注意：RNA實(shí)驗(yàn)用所有的試劑和無菌水都應(yīng)該專用，避免交叉污染。實(shí)驗(yàn)中，戴一次性手套，使用RNA操作專用實(shí)驗(yàn)臺，在操作過程中避免講話，避免汗液和唾液中的RNA分解酶的污染。 樣品的研磨與勻漿 ① 將超低溫凍結(jié)的RNA提取樣品（大鼠骨骼�。┓Q重后迅速轉(zhuǎn)移至用液氮預(yù)冷的研缽中，用研缽研磨組織，期間不斷加入液氮，直至研磨成粉末狀（無明顯的可見顆粒）。 ② 向研缽中加入適量的RNAiso Plus，將研磨成粉末狀的樣品完全覆蓋，然后室溫靜置，直至樣品完全融化，再用研杵繼續(xù)研磨至裂解液呈透明狀。 ③ 將勻漿液移至離心管，室溫靜置5min。 ④ 12 000g 4℃離心5min。 ⑤ 小心吸取上清液，移入新的離心管中，切勿吸取沉淀。 Total RNA的提取 ① 向上述步驟2中的勻漿裂解液中加入氯仿（RNAiso Plus的1/5體積量），蓋緊離心管蓋，用力振蕩（氯仿沸點(diǎn)低、易揮發(fā)、震蕩時應(yīng)小心離心管蓋突然彈開）。待充分乳化溶液呈乳白狀（無分相現(xiàn)象）后，再室溫靜置5min。 ② 12 000g 4℃離心15min。 ③ 從離心機(jī)中小心取出離心管，此時勻漿液分3層，即無色的上清液、中間的白蛋白層及帶有顏色的下層有機(jī)相。吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中（切忌取出白色中間層）。 ④ 向上清液中加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管，充分混勻后，在15~30℃靜置10min。 ⑤ 12 000g 4℃離心10min。在離心后，試管底部會出現(xiàn)沉淀。 ⑥ RNA沉淀的清洗：小心棄去上清，緩慢的沿離心管壁加入75%的乙醇1ml（切勿觸及沉淀），輕輕的上下顛倒洗滌離心管管壁，12，000g 4℃離心5min后小心棄去乙醇（為了更好的控制RNA中的鹽離子量，應(yīng)盡量除盡乙醇）。 RNA的溶解 室溫干燥沉淀2~5min（不可以離心或者加熱干燥，否則RNA很難溶解），加入適當(dāng)?shù)腞Nase-free水溶解沉淀，必要時可用移液槍輕輕吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80℃保存。 TransScript First-Strand cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟 取1μg 總RNA，與100pmole（10pmole/μL）oligo dT(20)混勻，75℃變性10分鐘，冰上退火，退火產(chǎn)物加DEPC水定容至20μL，全部加入Reverse transcript premix薄壁管中，42℃反應(yīng)1小時，85℃滅活15秒。其產(chǎn)物為first-Strand cDNA，可直接作為模板用于定量反應(yīng)。 Real-time PCR試劑盒操作步驟 QPCR Premix反應(yīng)體系20μl，其成分為: SyBR Green Real-time PCR MasterM I X 10μl,混合溶液2μl,正反向引物共2.4μl,cDNA模板2μl，消毒去離子水3.6μl。反應(yīng)條件:95℃ 預(yù)變性 30 s；95℃變性 5 s、60℃退火15s、72℃延伸45s，40個循環(huán)； -20℃ 保存。 |
2樓2010-12-11 01:13:57
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