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[交流] 【求助/交流】關(guān)于綠色熒光蛋白表達(dá)問(wèn)題

最近做綠色熒光蛋白的蛋白，將gfp基因轉(zhuǎn)座到受體菌的基因組上，表達(dá)。證實(shí)gfp是插進(jìn)去了的（有kan抗性篩選），第一次熒光顯微鏡檢測(cè)是可以觀察到熒光的，說(shuō)明gfp表達(dá)了，但后來(lái)就觀察不到了，怎么回事呢？是gfp表達(dá)不穩(wěn)定嗎?

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1樓 2010-11-17 09:48:28

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三磷酸腺苷

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silicare(金幣+1):謝謝參與 2010-11-17 12:06:45

首先是卡那和GFP是同等地轉(zhuǎn)座到基因組上，還是說(shuō)分成兩段分別插的？
如果是后者，只能說(shuō)是篩到了具有耐藥性質(zhì)的菌株

這種外源插進(jìn)去的東西會(huì)讓基因組不穩(wěn)定，復(fù)制的時(shí)候會(huì)丟失，所以要挑單克隆

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5樓2010-11-17 12:04:33

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同樣問(wèn)題

我的是轉(zhuǎn)到細(xì)胞里，看到綠色熒光蛋白了，所以做了共聚焦，結(jié)果就沒(méi)有看到蛋白表達(dá)，也不知道是怎么回事

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2樓2010-11-17 11:05:02

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lxblxb9

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Originally posted by 小乖小帥 at 2010-11-17 11:05:02:
我的是轉(zhuǎn)到細(xì)胞里，看到綠色熒光蛋白了，所以做了共聚焦，結(jié)果就沒(méi)有看到蛋白表達(dá)，也不知道是怎么回事

我更不知道是怎么回事，
我只想知道你們誰(shuí)能給我綠色熒光蛋白基因

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3樓2010-11-17 11:24:08

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等我問(wèn)清楚了再告訴你啊

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Originally posted by lxblxb9 at 2010-11-17 11:24:08:

我更不知道是怎么回事，
我只想知道你們誰(shuí)能給我綠色熒光蛋白基因

我直接做了轉(zhuǎn)染和篩選，前面的是老師設(shè)計(jì)的，我還不是很清楚，等我問(wèn)清楚了再告訴你啊

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4樓2010-11-17 11:53:20

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引用回帖:

Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-11-17 12:04:33:
首先是卡那和GFP是同等地轉(zhuǎn)座到基因組上，還是說(shuō)分成兩段分別插的？
如果是后者，只能說(shuō)是篩到了具有耐藥性質(zhì)的菌株

這種外源插進(jìn)去的東西會(huì)讓基因組不穩(wěn)定，復(fù)制的時(shí)候會(huì)丟失，所以要挑單克隆

是一起插進(jìn)去的�，F(xiàn)在的問(wèn)題是：將接合子在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基變綠了，但是取菌體熒光顯微鏡下觀察，沒(méi)有看到綠色熒光，而培養(yǎng)液變綠色了，現(xiàn)在準(zhǔn)備做蛋白電泳，看看有沒(méi)有GFP表達(dá)，有沒(méi)有誰(shuí)做過(guò)GFP表達(dá)的，GFP是胞內(nèi)還是胞外的？

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6樓2010-11-30 15:03:56

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三磷酸腺苷

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Originally posted by weiminhb at 2010-11-30 15:03:56:

是一起插進(jìn)去的。現(xiàn)在的問(wèn)題是：將接合子在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基變綠了，但是取菌體熒光顯微鏡下觀察，沒(méi)有看到綠色熒光，而培養(yǎng)液變綠色了，現(xiàn)在準(zhǔn)備做蛋白電泳，看看有沒(méi)有GFP表達(dá)，有沒(méi)有誰(shuí)做過(guò)GFP ...

是不是不小心在GFP加了個(gè)神馬分泌的信號(hào)
另外有可能是你表達(dá)了毒蛋白，把宿主給殺了，所以……

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7樓2010-11-30 18:28:18

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8樓2012-04-24 11:12:58

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是不是有可能在傳代過(guò)程中，綠色熒光蛋白基因從基因組中轉(zhuǎn)座或是重組消失了？可以在不能檢測(cè)到熒光的細(xì)胞中驗(yàn)證一下gfp基因的存在，僅供參考！

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9樓2012-04-24 14:00:54

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emma立夏

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還有一個(gè)原因，就是熒光淬滅。所以也有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)說(shuō)，要加一些固定劑的。記得丙酮是一個(gè)很不錯(cuò)的固定劑。

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10樓2012-05-11 20:32:17

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yili_90

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將基因插入綠色熒光載體中，并轉(zhuǎn)染進(jìn)入293T細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，48小時(shí)后觀察細(xì)胞沒(méi)有發(fā)現(xiàn)熒光，但重組載體測(cè)序正常，不知道什么原因

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11樓2014-03-24 22:39:41

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