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亂馬123新蟲 (初入文壇)
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[交流]
【求助/交流】xho1單酶切，總連不上(片段3K,載體5K) 已有6人參與
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由于目的片段的限制，只能單酶切。 片段3K，載體5K,用NEB的T4連接酶，10ul體系中加1ul酶，載體：片段=1:10。 16度連接過(guò)夜。連過(guò)很多次，總是長(zhǎng)出很多菌落（多為載體自連），挑菌做pcr,沒有條帶。 到底是哪里的問題，還請(qǐng)各位幫忙！先謝謝了！ |
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小木蟲(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖交流
amisking(金幣+2):good！ 2011-01-07 22:57:51
小木蟲(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖交流
amisking(金幣+2):good！ 2011-01-07 22:57:51
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載體去磷酸化一點(diǎn)都不麻煩，不就還是一個(gè)酶和底物反應(yīng)的過(guò)程 就算改變了連接比例，還是有自連出現(xiàn) 到時(shí)候你一個(gè)個(gè)去做菌落PCR鑒定還是坑爹啊 我現(xiàn)在做短基因合成和連接，只需挑一個(gè)克隆測(cè)序，克隆了二十幾個(gè)到目前為止100%成功。我只要保證載體徹底酶切就可以了，長(zhǎng)出來(lái)鐵定是陽(yáng)性克隆。 |
8樓2011-01-07 22:44:02
9樓2012-06-19 16:31:49
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