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pUC19-SalI單酶切，連個(gè)2500片段，連不上？
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最近在做單酶切連接，怎么也連不上，請大家?guī)兔Γ?br />
pUC19和2500bp的目的片段通過SalI單酶切，進(jìn)行連接，不知道什么原因總是連不上？ 本不應(yīng)該難連啊？ |
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wanhscn
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2樓2011-09-05 22:09:31
3樓2011-09-06 09:53:27
wanhscn
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4樓2011-09-06 10:00:01
5樓2011-09-06 11:51:57
【答案】應(yīng)助回帖
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wanhscn(金幣+2): good 2011-09-06 14:13:54
shuihaizi(金幣+2): 2011-09-06 16:25:18
wanhscn(金幣+2): good 2011-09-06 14:13:54
shuihaizi(金幣+2): 2011-09-06 16:25:18
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目的片段比較大沒有關(guān)系的，載體必須要去磷酸化的，因?yàn)槟阕龅氖菃蚊盖�。沒有去磷酸化很容易自連。連接的反應(yīng)體系不應(yīng)過大。體系過大，濃度越低，分子碰撞的概率越低，這樣連接的概率也就越低了。一般連接的反應(yīng)體系為10μL. 載體 1μL 目的片段 7μL 10×T4 DNA ligase 1μL T4 DNA ligase 1μL 16℃連接過夜。 注意要加好對照，這樣便于你分析結(jié)果。 祝你好運(yùn)！ |
6樓2011-09-06 12:33:28
36894256
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7樓2011-09-06 13:30:17
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
shuihaizi(金幣+3): 2011-09-06 16:26:05
西瓜(金幣+5): Good 2011-09-06 17:25:33
shuihaizi(金幣+3): 2011-09-06 16:26:05
西瓜(金幣+5): Good 2011-09-06 17:25:33
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1.如果是用T4連接酶，按20ul體系： 載體 100ng 目的片段 500-1000ng 10×T4 DNA ligase 2μL T4 DNA ligase 1μL 25℃連接30min。 片段不需去磷 2.如果用快速克隆酶（該方法陽性率很高） 載體 100ng 目的片段 100-300ng 10×快速克隆酶buffer 2μL 快速克隆酶 2μL 25℃連接30min。 片段不需去磷 本人構(gòu)建過二十多個(gè)克隆，90%一次性成功 |
8樓2011-09-06 14:15:23
9樓2011-09-06 16:27:38
10樓2011-09-06 16:29:26
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