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【原創(chuàng)】非變性凝膠電泳原理及應(yīng)用實(shí)例 已有1人參與
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現(xiàn)在大家都是做SDS-PAGE或者雙向電泳比較多，而做非變性電泳的似乎少一些。而我本人接觸非變形電泳較多，一直認(rèn)為它還是很有特點(diǎn)的，能夠有很多獨(dú)特應(yīng)用之處的，所以在此結(jié)合我本人經(jīng)歷向大家介紹一下非變性電泳。 非變性電泳，蛋白質(zhì)在電泳過程中是處于非變性的，電泳時蛋白的遷移率取決于蛋白的電荷和分子量，非變性電泳在完成電泳后，可以進(jìn)行蛋白質(zhì)活性測定（如果是酶的話，可以進(jìn)行酶活檢測）或者檢測同功酶，或含亞基的完整蛋白的分子量，這些特點(diǎn)是SDS-PAGE所不具備的，因?yàn)橄馭DS-PAGE使蛋白變性，亞基解離，無法體現(xiàn)含有亞基的蛋白的真實(shí)分子量，也無法進(jìn)行后續(xù)的蛋白活性檢測了。 非變性電泳和SDS-PAGE相比，其實(shí)基本試驗(yàn)操作是相同的，所以在此我也不一一詳敘了。最大的不同就是樣品中的蛋白是沒有變性的，所以電泳樣品是沒有煮沸的，而且樣品處理液中也是不含去垢劑的。此外的差異還有： 1：在非變性電泳中，體系的PH通常為8.8（濃縮膠和分離膠的PH 8.8）因而大多數(shù)蛋白質(zhì)在這個條件下是帶負(fù)電的。當(dāng)然我想地球上也會有pI大于8.8的蛋白質(zhì)，這樣的條件下，要用低PH系統(tǒng)（這個完全是另一套系統(tǒng)，緩沖體系也不同，我這里就不深入了，有興趣的可以去參考一下汪家政主編的《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊》），同時把電泳體系得陰極和陽極倒置就好了，蛋白往膠里跑就行。 2：非變性電泳體系中的離子強(qiáng)度盡量不要太高，離子強(qiáng)度高了會影響蛋白活性；在電泳的時候發(fā)熱也比較厲害。但如果離子強(qiáng)度太低了，可能導(dǎo)致非特異性凝聚。我一般緩沖體系（Tris-Hcl）的離子強(qiáng)度在0.01-0.1mol/L，離子強(qiáng)度是要比SDS-PAGE低的。配膠時Tris-Hcl濃度同樣是要低的。 3：雖然電泳產(chǎn)熱比起western電轉(zhuǎn)是少很多了，但是還是不能忽視啊~所以我一般做非變性電泳還是會用冰浴的，安全起見嘛，就怕酶失活。我做SDS-PAGE就不會用冰浴。 4：因?yàn)榈鞍踪|(zhì)未變性，含有亞基的蛋白肯定更大，泳動速度也慢（非變性條件下，蛋白所帶的電荷一般來說也更少），膠的濃度還是小點(diǎn)好，5%-10%就行，我做catalase的非變性電泳膠的濃度是7%（后面我會給一些操作和應(yīng)用實(shí)例，和圖片）。SDS-PAGE的條帶區(qū)分開主要是靠分子量大小，而非變性電泳的話，分子量和所帶電荷的多少都是影響因素，這個值得注意。 下面我講兩個應(yīng)用實(shí)例，這樣讓大家也能體會到非變性電泳的實(shí)際用途。（這兩個例子都是本人做的，謝絕轉(zhuǎn)載哦） 第一個例子：電泳檢測胰蛋白活力， 這個試驗(yàn)是當(dāng)初我做蛋白純化時候做的一個試驗(yàn)，挺有意思的，活性電泳的試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了我當(dāng)初從一個公司買的胰蛋白酶粗品沒有酶活，真的是一點(diǎn)都沒有！那個公司的偽劣產(chǎn)品嚴(yán)重干擾了我的試驗(yàn)進(jìn)度，最后我還是從肉聯(lián)廠買的胰臟，自己從頭提取。（這個慘痛的經(jīng)歷一直教育我，試驗(yàn)材料和試劑什么的，一定要從有信譽(yù)的公司買啊）。 現(xiàn)在和大家分享一下具體細(xì)節(jié)：試驗(yàn)用的其實(shí)是SDS-PAGE體系，但是樣品上樣前是沒有煮沸的；而在電泳完成后，用Tris-Hcl緩沖液清洗分離膠，可以充分去除SDS，之后再用清水清洗3次。置于50mmol/L的Tris-HCl (pH 7.5)中37℃溫育8小時，就可以用R250染色了。 在分離膠里是加了明膠的，作用在于胰蛋白酶能降解明膠，按上述步驟處理過后，就可以染色，整塊膠被R250染成藍(lán)色背景，而被胰蛋白酶降解的區(qū)域不會被染色，仍為透明的（這和通常凝膠的考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果正好相反的），可以檢測胰蛋白酶所處的條帶，而且條帶寬度能體現(xiàn)量效關(guān)系。還是給圖比較直觀：（圖1） 對了，給篇參考文獻(xiàn)：《用于植物光系統(tǒng)II蛋白酶檢測的活性染色方法》 好，繼續(xù)。 第二個例子是我做的過氧化氫酶catalase的活性電泳。 這個體系中就沒有SDS了，樣品處理液中我連β-巰基乙醇都沒加。分離膠濃度為7%（pH 8.8），濃縮膠濃度為4%（pH 6.8）。提取的蛋白樣品用2×樣品處理液（20%(w/v)甘油以及0.01%(w/v)溴酚藍(lán)，0.125mol/LTris-HCl，pH 6.8）溶解。 過氧化氫酶的染色采用負(fù)染色，用蒸餾水將電泳后的聚丙烯酰胺凝膠沖洗2次，然后用0.3%的H2O2浸泡凝膠5 min，在浸泡過程中不斷震蕩染色盤，使之浸泡均勻。浸泡結(jié)束后，倒掉H2O2液，用蒸餾水將凝膠沖洗2次。再用50 mL2%鐵氰化鉀和50 mL2%三氯化鐵混合液進(jìn)行負(fù)染色10分鐘。直到凝膠在藍(lán)紫色背景上出現(xiàn)草綠色酶帶時停止染色。倒掉染色液后，用蒸餾水沖洗凝膠2次。在這里，順便給個染色后的效果圖：（圖2） 我做的植物材料只有一種catalase同工酶。其實(shí)在很多植物中catalase同功酶還是比較多的，所以往往有好幾條帶，同工酶還往往是分類，種屬鑒定的輔助手段，同工酶和非變性電泳的用途，大家可以參考以下《電泳》一書（主編何忠效，張樹政），講得比我好多啦。里面膠的配方也講得很詳細(xì)。 講到這里就差不多啦，歡迎大家來此討論。（我打字打了好久啊，原創(chuàng)的�。� |
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樓主夠熱情，同時我也想介紹一些我的看法和做法，借樓主寶地，還請不要介意。與樓主不同之處，可能是因?yàn)樽龅牡鞍踪|(zhì)不同，就當(dāng)豐富主帖內(nèi)容，無對錯之分。 1、蛋白質(zhì)形狀也會影響在非變性電泳中的泳動速度，不是所有蛋白質(zhì)都是球狀或者幾乎是球狀的，例如有些有CBM的纖維素酶，或者某些有長鏈糖基化修飾的蛋白質(zhì)。 2、即使是變性電泳，蛋白質(zhì)也可以進(jìn)行復(fù)性嘗試，可以復(fù)性，但不知道是不是已經(jīng)100%復(fù)性，沒計(jì)算過比例。例如纖維素酶。 3、是否需要把電泳槽放在冰水混合物中不僅與緩沖液的離子強(qiáng)度有關(guān)，還與緩沖液使用次數(shù)有關(guān)，如果目的蛋白質(zhì)耐高溫，那也不用這樣費(fèi)事。 4、跑完電泳之后要染色，漂洗不用那么多步驟，泡久了蛋白質(zhì)會有一點(diǎn)跑到溶液里去的，不知道樓主是否測定過漂洗過后有多少蛋白質(zhì)跑了出來，或者蛋白質(zhì)帶變寬，似乎有一個所謂的“固定”說法。我只用清水蕩滌一下就行，大多數(shù)情況是從電泳槽里拿出來之后直接考染，沒那么多步驟。 既然樓主熱情，我就給5星評價。 |
10樓2011-01-30 17:23:06
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1、“SDS-PAGE體系，但是樣品上樣前是沒有煮沸的”，這樣能夠使多少蛋白質(zhì)，或者說你的目的蛋白質(zhì)保持活性？是否不加變性劑，有助于更多的蛋白質(zhì)保持活性？有沒有想過這個問題？有沒有測定過目的蛋白質(zhì)得率？ 2、“而在電泳完成后，用Tris-Hcl緩沖液清洗分離膠，可以充分去除SDS”。既然要清洗，為什么要加SDS？ 3、“用Tris-Hcl緩沖液清洗分離膠，可以充分去除SDS，之后再用清水清洗3次。置于50mmol/L的Tris-HCl (pH 7.5)中37℃溫育8小時”。有沒有考慮過此時能有多少目的蛋白質(zhì)在電泳膠中？有多少在清洗和溫浴中損失掉了？ 4、“就可以用R250染色了”。R250應(yīng)為考染。 5、“在分離膠里是加了明膠的，作用在于胰蛋白酶能降解明膠，按上述步驟處理過后，就可以染色，整塊膠被R250染成藍(lán)色背景，而被胰蛋白酶降解的區(qū)域不會被染色，仍為透明的”。 沒有脫色步驟，是否說明即使不用脫色，考馬斯亮藍(lán)也不能把沒有明膠的地方染藍(lán)？如果有脫色步驟，那么本來處在明膠降解帶處的酶哪里去了？ “（這和通常凝膠的考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果正好相反的）” 說明在漂洗和溫�。ū３汁h(huán)境恒定讓酶降解明膠）的過程中跑出凝膠了？ 請樓主解惑 |
12樓2011-01-31 15:30:22
冼亮淀粉酶
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看樣子討論結(jié)果已經(jīng)幾乎明了了，我再贅言幾句： 1、SDS含量多少對各種蛋白質(zhì)的變性作用應(yīng)該是有可能不同的，所以我覺得在做非變性電泳時能否用SDS-PAGE體系，能用的話怎么樣用，這值得思考。SDS對蛋白質(zhì)活性的抑制作用是否都是可逆的，這也值得摸索各人實(shí)驗(yàn)各自摸索。 2、對于我來說，如果想知道淀粉酶有沒有活力，可以使用更直接的方法，測定酶活力就行，測定過程只需要十分鐘，但做一個電泳來驗(yàn)證有沒有活性，從樣品準(zhǔn)備跑膠到染色一系列下來至少5小時。所以樓主說那個實(shí)驗(yàn)是用來驗(yàn)證有沒有活性的，我就覺得是不是樓主的胰蛋白酶在那個實(shí)驗(yàn)階段是不是仍不適宜測定酶活力？底物是否只用明膠最合適？而不適宜用酪蛋白之類的底物來測定？既然樓主在后面的純化中要計(jì)算得率，那么所用來測定酶活力的方法是什么？能不能代替非變性膠這個耗時長的實(shí)驗(yàn)來檢測蛋白酶有無活力？會不會更省時？ 3、我知道做細(xì)胞內(nèi)全蛋白質(zhì)的染色可以只染半小時就能清楚看到幾十條蛋白質(zhì)帶的，而你所說的胰蛋白酶染色需要較長時間，這是否與染色液有關(guān)？考馬斯亮藍(lán)與蛋白質(zhì)結(jié)合很穩(wěn)定的，你染不上，是所用考馬斯亮藍(lán)濃度特別低還是染色過程極其短？你說的時間很短，究竟有多短？在提取非變性膠里的蛋白質(zhì)的時候有人是把膠切碎浸泡，使蛋白質(zhì)從膠里跑出來的，所以我有一個疑問，你的胰蛋白酶是不是在漂洗和浸泡過程中跑掉了所以只有降解帶而沒有蛋白質(zhì)帶？ 放假了，回家不能做實(shí)驗(yàn)不能進(jìn)庫看文獻(xiàn)，所以才有空糾結(jié)一下小木蟲，如果樓主忙就不要管我這個閑人了。 |
14樓2011-01-31 22:01:22
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40樓2014-08-11 11:13:42
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