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[交流]
【求助/交流】P不出正確條帶
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| 我設(shè)計(jì)的引物是900的，但是在750出來(lái)了一個(gè)，500出來(lái)了一個(gè)，我P 了好幾次，否沒(méi)有得到正確條帶，請(qǐng)問(wèn)是怎么回事啊？是反映條件的問(wèn)題還是引物問(wèn)題？如果是反映條件的問(wèn)題，該如何改進(jìn)？如果是引物的問(wèn)題，有沒(méi)有什么辦法可以驗(yàn)證引物的正確性��？ |
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我的引物序列是從文獻(xiàn)上看的，我想知道如何判斷它是否合理。請(qǐng)教一下，該怎么進(jìn)行同源性檢查？謝謝！ 你可以先從美國(guó)NCBI網(wǎng)站去查找一下原始序列，看相關(guān)原始序列能否找到，是否正確，我曾碰到這樣的情況，從一篇文獻(xiàn)中的序列按相關(guān)原則反向推出的序列比對(duì)原始序列，中間少一個(gè)堿基，其余各項(xiàng)情況符合，這個(gè)肯定無(wú)法PCR出來(lái)，問(wèn)過(guò)老師，為什么會(huì)出現(xiàn)這種情況，老師說(shuō)，有些人為保護(hù)所謂的隱私權(quán)之類的，會(huì)故意更改或增減相關(guān)堿基，導(dǎo)致按照文獻(xiàn)根本無(wú)法做出來(lái)。所以按照文獻(xiàn)操作要慎重，最好自己設(shè)計(jì)。我課題的幾個(gè)引物全是自己設(shè)計(jì)的，比我從文獻(xiàn)上找的，效果都要好。 同源性檢查也是在NCBI網(wǎng)站中去做，講起來(lái)比較麻煩，你可以咨詢分子生物學(xué)相關(guān)專業(yè)的師兄、師姐或老師，讓他們具體教一下你。 設(shè)計(jì)引物主要涉及到引物長(zhǎng)度，產(chǎn)物長(zhǎng)度，退火溫度，是否會(huì)形成發(fā)卡結(jié)、二聚體之類的。 |
17樓2011-01-10 08:32:03
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你可以先從美國(guó)NCBI網(wǎng)站去查找一下原始序列，看相關(guān)原始序列能否找到，是否正確，我曾碰到這樣的情況，從一篇文獻(xiàn)中的序列按相關(guān)原則反向推出的序列比對(duì)原始序列，中間少一個(gè)堿基，其余各項(xiàng)情況符合，這個(gè)肯定無(wú)法PCR出來(lái)，問(wèn)過(guò)老師，為什么會(huì)出現(xiàn)這種情況，老師說(shuō)，有些人為保護(hù)所謂的隱私權(quán)之類的，會(huì)故意更改或增減相關(guān)堿基，導(dǎo)致按照文獻(xiàn)根本無(wú)法做出來(lái)。所以按照文獻(xiàn)操作要慎重，最好自己設(shè)計(jì)。我課題的幾個(gè)引物全是自己設(shè)計(jì)的，比我從文獻(xiàn)上找的，效果都要好。 同源性檢查也是在NCBI網(wǎng)站中去做，講起來(lái)比較麻煩，你可以咨詢分子生物學(xué)相關(guān)專業(yè)的師兄、師姐或老師，讓他們具體教一下你。 設(shè)計(jì)引物主要涉及到引物長(zhǎng)度，產(chǎn)物長(zhǎng)度，退火溫度，是否會(huì)形成發(fā)卡結(jié)、二聚體之類的。 |
18樓2011-01-10 08:33:44
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