ikaren2013

金蟲 (小有名氣)

應(yīng)助: 1 (幼兒園)
金幣: 949.1
帖子: 143
在線: 102.1小時
蟲號: 786738

[交流] 【求助/交流】引物Tm值很高，PCR求助

由于要做點(diǎn)突變，且突變位置很特殊很特殊，（考慮到突變位置，引物3'端配對長度），所以只能針對突變點(diǎn)限定性地設(shè)計了幾對引物。軟件給出的Tm值相當(dāng)高。相對于以下的結(jié)果圖
   第一對引物 Tm

   第二對引物 Tm

   第三對引物 Tm

   第四對引物 Tm

   摸條件四次結(jié)果，都非常不好，（也用過熱啟動，什么都沒P出來，只有引物二聚體），急求解決方法.目的片段大小約為700bp




   下圖能看到每個體系都有十分微弱的目的條帶


   下圖中的1,2,3為兩點(diǎn)溫度法


[ Last edited by ikaren2013 on 2011-1-14 at 11:36 ]

回復(fù)此樓

» 猜你喜歡

不合理蛙科研實驗中的趣事：實驗器材的 “烏龍” 已經(jīng)有0人回復(fù)
不合理蛙科研實驗中的趣事：和實驗材料的 “斗智斗勇” 已經(jīng)有0人回復(fù)
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤色/翻譯怎么收費(fèi)? 已經(jīng)有285人回復(fù)
蛋白質(zhì)檢測：精準(zhǔn)分析，解鎖生物分子的密碼已經(jīng)有0人回復(fù)
不合理蛙科研實驗之小鼠實驗：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計，解析生命機(jī)制的重要載體已經(jīng)有0人回復(fù)
不合理蛙科研實驗之重金屬檢測：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線已經(jīng)有0人回復(fù)
不合理蛙科研實驗之“蛙測重金屬我背鍋三千” 已經(jīng)有0人回復(fù)
不合理蛙科研實驗之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI” 已經(jīng)有0人回復(fù)
納米粒度分析已經(jīng)有3人回復(fù)
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標(biāo)南京已經(jīng)有0人回復(fù)

» 本主題相關(guān)價值貼推薦，對您同樣有幫助:

求助 TD_SCDMA tm代碼已經(jīng)有4人回復(fù)
設(shè)計引物Tm值過高？？？已經(jīng)有7人回復(fù)
PCR定點(diǎn)突變遇到問題已經(jīng)有9人回復(fù)
Takara 引物合成已經(jīng)有5人回復(fù)
重疊PCR引物，兩個片段分別回收后存在雜帶是怎么回事已經(jīng)有4人回復(fù)
反向PCR為什么需要兩套引物呀已經(jīng)有7人回復(fù)
高保真KOD和PCR的應(yīng)用有哪些不同？已經(jīng)有10人回復(fù)
RT—PCR引物、條帶問題，新手求助，求意見，求建議！已經(jīng)有9人回復(fù)
有人用TaKaRa的PrimeSTAR HS DNA Polymerase P長片段已經(jīng)有9人回復(fù)
求助重疊延伸pcr 已經(jīng)有5人回復(fù)
定點(diǎn)突變引物設(shè)計已經(jīng)有8人回復(fù)
重疊延伸PCR引物合成求助已經(jīng)有15人回復(fù)
重疊延伸PCR設(shè)計引物已經(jīng)有3人回復(fù)
如何設(shè)計重疊延伸PCR引物已經(jīng)有14人回復(fù)
ＲＴ－ＰＣＲ問題求助已經(jīng)有18人回復(fù)
【求助/交流】同源克隆設(shè)計的引物Tm值過低怎么辦已經(jīng)有12人回復(fù)
【求助/交流】引物的PCR Tm值請教已經(jīng)有7人回復(fù)

» 搶金幣啦！回帖就可以得到:

查看全部散金貼

1樓 2011-01-13 22:09:58

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

回帖支持 ( 顯示支持度最高的前 50 名 )

baichangming

銀蟲 (小有名氣)

應(yīng)助: 2 (幼兒園)
金幣: 850.2
帖子: 212
在線: 98.9小時
蟲號: 320766

★
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖

據(jù)說，引物的Tm值若是過高，直接兩步PCR就可以了。

贊一下(1人)

回復(fù)此樓

17樓2013-11-19 17:52:15

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

普通回帖

yixuanwin

鐵桿木蟲 (正式寫手)

★
最愛花詩雨(金幣+1):鼓勵交流~~ 2011-01-14 09:07:17

我的引物都是20-26bp 沒做過40bp的。。。。。

贊一下(1人)

回復(fù)此樓

2樓2011-01-13 23:51:13

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

墨香若水

木蟲 (著名寫手)

★ ★
最愛花詩雨(金幣+2):熱心的蟲蟲~~ 2011-01-14 09:08:07

強(qiáng)烈建議LZ換pfu酶，fermentals的不錯價格也便宜。我做突變沒出過問題。Tm這些應(yīng)該沒問題，PCR要求沒這么嚴(yán)格。關(guān)鍵是酶，KOD太矯情了。

贊一下(1人)

回復(fù)此樓

3樓2011-01-14 06:53:21

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

shaquila

金蟲 (正式寫手)

★ ★
dhd997(金幣+2):謝謝交流 2011-01-14 10:12:49

引用回帖:

Originally posted by 墨香若水 at 2011-01-14 06:53:21:
強(qiáng)烈建議LZ換pfu酶，fermentals的不錯價格也便宜。我做突變沒出過問題。Tm這些應(yīng)該沒問題，PCR要求沒這么嚴(yán)格。關(guān)鍵是酶，KOD太矯情了。

KOD還好阿，用takara的extaq和PRIMER STAR做不出來，用它都能出來，但是如果按推薦體系，非特異擴(kuò)增多了點(diǎn)。你的引物這么長，退火時間是不是要長點(diǎn)，而且如果退火溫度較低，有可能有雜帶

贊一下(1人)

回復(fù)此樓

4樓2011-01-14 08:16:44

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

xulanzzz

金蟲 (著名寫手)

★
dhd997(金幣+1):謝謝交流 2011-01-14 10:12:57

引物長度大于30bp的退火溫度不必參考軟件上的TM。。。我的引物36bp，軟件上面顯示的退火溫度高達(dá)80多度，50多度照樣可以PCR。。。

贊一下(1人)

回復(fù)此樓

5樓2011-01-14 09:48:20

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

王會征

鐵桿木蟲 (著名寫手)

應(yīng)助: 1 (幼兒園)
金幣: 9507.7
帖子: 1066
在線: 243.3小時
蟲號: 470121

建議退火和延伸合成一步進(jìn)行PCR啊

贊一下

回復(fù)此樓

6樓2011-01-14 10:05:32

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

墨香若水

木蟲 (著名寫手)

樓主你突變用什么方法，Tm雖然高但是跟模板結(jié)合的引物部分應(yīng)該不是整個你的引物吧。

贊一下

回復(fù)此樓

7樓2011-01-14 11:24:04

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

ikaren2013

金蟲 (小有名氣)

應(yīng)助: 1 (幼兒園)
金幣: 949.1
帖子: 143
在線: 102.1小時
蟲號: 786738

內(nèi)容已刪除

回復(fù)此樓

8樓2011-01-14 11:33:08

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

shaquila

金蟲 (正式寫手)

★ ★
rainwander(金幣+2):沒操作過也沒問題，積極參與的精神可嘉~~ 2011-01-15 10:52:21

我沒做過定點(diǎn)突變，但是我覺得要考慮兩個因素，一個是啟始的引物模板mismatch，而且退火溫度要根據(jù)真正匹配的部份來確定，好像設(shè)計引物的軟件可以算出mismatch的退火溫度，第二點(diǎn)要考慮mismatch不能太靠近三端吧，不然結(jié)合有問題�？梢钥紤]一開始較低溫度擴(kuò)增，后提高溫度。也可以設(shè)計一個長引物和然后去除其三端部份序列得到一個短引物，用兩引物的混合物做為引物進(jìn)行PCR，注意長引物量要小于短引物，至少1:5。一點(diǎn)拙見，呵呵，沒實際操作過

贊一下(1人)

回復(fù)此樓

9樓2011-01-15 10:36:20

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

zhangxn2010

木蟲 (著名寫手)

是的，主要是引物片段太長了，不過換用好體系的話，還是不成問題的，好運(yùn)！

贊一下

回復(fù)此樓

10樓2011-01-15 11:26:13

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

haitian0625

金蟲 (小有名氣)

應(yīng)助: 7 (幼兒園)
金幣: 1392.4
帖子: 123
在線: 56.9小時
蟲號: 903890

在考慮上面建議的同時，是否可以做下Mg離子梯度，敝人感覺鎂離子有些多吧。

贊一下

回復(fù)此樓

11樓2011-01-15 16:12:44

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

haitian0625

金蟲 (小有名氣)

應(yīng)助: 7 (幼兒園)
金幣: 1392.4
帖子: 123
在線: 56.9小時
蟲號: 903890

期待樓主的解決方案分享啊！

贊一下

回復(fù)此樓

12樓2011-01-15 16:13:26

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

墨香若水

木蟲 (著名寫手)

引用回帖:

Originally posted by ikaren2013 at 2011-01-14 11:33:08:

我用普通PCR拉目的片段。我的突變位置很特殊，位于目的片段的起始部分。不能用重疊PCR來做此突變。
我的引物長度39bp中，含有酶切位點(diǎn)和三個保護(hù)性堿基。（即使除去這些，剩下的31bp，Tm值依然很高。）剩下的3 ...

樓主如果只有一兩個堿基突變為什么不設(shè)計一對互補(bǔ)引物，其中突變點(diǎn)位于中間突變點(diǎn)兩端各有15~20bp pfu直接PCR獲得nicked plasmid 再DPn1 消化模板

贊一下

回復(fù)此樓

13樓2011-01-15 22:05:27

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

wuw579

鐵桿木蟲 (正式寫手)

應(yīng)助: 0 (幼兒園)
金幣: 6643.2
帖子: 344
在線: 102.1小時
蟲號: 1188591

要不做巢式PCR試試

贊一下

回復(fù)此樓

14樓2011-01-17 20:52:09

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

madengyu

禁蟲 (小有名氣)

★
小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖

本帖內(nèi)容被屏蔽

15樓2011-08-03 11:16:04

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

btx362237729

金蟲 (正式寫手)

應(yīng)助: 18 (小學(xué)生)
金幣: 927.7
帖子: 745
在線: 66.3小時
蟲號: 1069351

★
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖

引用回帖:

279232樓: Originally posted by xulanzzz at 2011-01-14 09:48:20
引物長度大于30bp的退火溫度不必參考軟件上的TM。。。我的引物36bp，軟件上面顯示的退火溫度高達(dá)80多度，50多度照樣可以PCR。。。

本人也遇到高TM值的問題了哈哈。。�？吹竭@個覺得很鼓舞

贊一下

回復(fù)此樓

16樓2012-06-16 20:33:07

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

霧里看花花開

金蟲 (正式寫手)

應(yīng)助: 3 (幼兒園)
金幣: 2141.5
帖子: 412
在線: 192.2小時
蟲號: 3035067

★
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖

內(nèi)容已刪除

回復(fù)此樓

18樓2014-03-26 12:38:40

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

最具人氣熱帖推薦 [查看全部]	作者	回/看	最后發(fā)表

[考研] 085404電子信息284分求調(diào)劑 +3	13659058978 2026-03-24	3/150	2026-03-24 10:26 by wangkm
[考研] 298-一志愿中國農(nóng)業(yè)大學(xué)-求調(diào)劑 +11	手機(jī)用戶 2026-03-17	12/600	2026-03-23 23:51 by 熱情沙漠
[考研] 招08考數(shù)學(xué) +6	laoshidan 2026-03-20	14/700	2026-03-23 14:37 by 15614359529
[考研] 307求調(diào)劑 +3	余意卿 2026-03-21	3/150	2026-03-23 10:32 by Iveryant
[考研] 293求調(diào)劑 +3	濤濤Wjt 2026-03-22	5/250	2026-03-22 22:21 by jiangpengfei
[考研] 求調(diào)劑一志愿海大，0703化學(xué)學(xué)碩304分，有大創(chuàng)項目，四級已過 +6	幸運(yùn)哩哩 2026-03-22	10/500	2026-03-22 20:10 by edmund7
[考研] 生物學(xué)071000 329分求調(diào)劑 +5	我愛生物生物愛?/a> 2026-03-17	5/250	2026-03-22 16:42 by tcx007
[考研] 285求調(diào)劑 +6	ytter 2026-03-22	6/300	2026-03-22 12:09 by 星空星月
[考研] 初試 317 +7	半拉月丙 2026-03-20	7/350	2026-03-21 22:26 by peike
[考研] 考研調(diào)劑 +3	呼呼？~+123456 2026-03-21	3/150	2026-03-21 20:04 by 無際的草原
[考研] 266求調(diào)劑 +3	哇呼哼呼哼 2026-03-20	3/150	2026-03-21 16:46 by barlinike
[考研] 279求調(diào)劑 +5	紅衣隱官 2026-03-21	5/250	2026-03-21 14:59 by lature00
[考研] 22 350 本科985求調(diào)劑，求老登收留 +3	李軼男003 2026-03-20	3/150	2026-03-21 13:28 by 搏擊518
[考研] 332求調(diào)劑 +4	ydfyh 2026-03-17	4/200	2026-03-21 02:20 by JourneyLucky
[考研] 一志愿華南師大 070300（化學(xué)）304分求調(diào)劑 +3	0703武芊慧雪304 2026-03-18	3/150	2026-03-21 00:48 by JourneyLucky
[考研] 353求調(diào)劑 +3	拉鉤不許變 2026-03-20	3/150	2026-03-20 19:56 by JourneyLucky
[考研] 一志愿吉林大學(xué)材料學(xué)碩321求調(diào)劑 +11	Ymlll 2026-03-18	15/750	2026-03-20 19:40 by 丁丁*
[考研] 一志愿南理工085701環(huán)境302求調(diào)劑院校 +3	葵梓衛(wèi)隊 2026-03-20	3/150	2026-03-20 19:28 by zhukairuo
[考研] 0703化學(xué)調(diào)劑 +4	18889395102 2026-03-18	4/200	2026-03-19 16:13 by 30660438
[考研] 材料考研調(diào)劑 +3	xwt。 2026-03-19	3/150	2026-03-19 11:22 by w沐陽w