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[交流] 【求助/交流】我做轉(zhuǎn)基因,如何把質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中?

自己有農(nóng)桿菌菌株,向外單位要了基因.還是簽了協(xié)議的.
別人給我們的基因應(yīng)該是質(zhì)粒形態(tài)的還是整合在大腸桿菌里的?應(yīng)該不會(huì)是簡單的雙鏈DNA吧,我想的話.

如果是整合在大腸桿菌里的,我該怎么把基因弄到農(nóng)桿菌中去?
如果是質(zhì)粒形態(tài)的,我該怎么把基因弄到農(nóng)桿菌里面去?

我需要技術(shù)路線,和注意事項(xiàng).....謝謝....具體實(shí)驗(yàn)操作可以網(wǎng)上搜索.
謝謝.

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1樓 2011-01-14 13:00:18

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ben1147

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完了(金幣+1):謝謝參與
rainwander(金幣+2):很詳細(xì)啊，鼓勵(lì)積極參與交流~~~ 2011-01-14 14:18:35

一般應(yīng)該都是質(zhì)粒吧，但是要看目的基因所在的質(zhì)粒是什么質(zhì)粒。如果是已經(jīng)構(gòu)建好的雙元載體，那直接搖起來，提了質(zhì)粒，轉(zhuǎn)到農(nóng)桿菌里就行
要是只是一般的克隆用的大腸的質(zhì)粒，那要提了質(zhì)粒，把目的基因切下來或者P下來，然后連到雙元載體上，轉(zhuǎn)化大腸，挑克隆提質(zhì)粒驗(yàn)證正確之后再轉(zhuǎn)到農(nóng)桿菌里
如果確實(shí)目的基因是在菌的染色體上，那就得先P，連克隆載體，再做亞克隆到雙元載體上轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。
具體哪種情況問問那個(gè)外單位，肯定是知道的。
至于質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，原理沒什么特別的，和轉(zhuǎn)大腸一樣，只不過制備感受態(tài)的溶液氯化鈣濃度不太一樣，要低一些。另外就是大腸是冰浴、42熱激，農(nóng)桿菌是液氮冷凍，37熱激。另外復(fù)蘇、培養(yǎng)時(shí)間什么的也要延長

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2樓2011-01-14 13:39:45

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引用回帖:

Originally posted by ben1147 at 2011-01-14 13:39:45:
一般應(yīng)該都是質(zhì)粒吧，但是要看目的基因所在的質(zhì)粒是什么質(zhì)粒。如果是已經(jīng)構(gòu)建好的雙元載體，那直接搖起來，提了質(zhì)粒，轉(zhuǎn)到農(nóng)桿菌里就行
要是只是一般的克隆用的大腸的質(zhì)粒，那要提了質(zhì)粒，把目的基因切下來或者P ...

如果只是一般的克隆用的大腸的質(zhì)粒,那我還需要索要一個(gè)雙元載體吧?否則就要自己構(gòu)建一個(gè)雙元載體?

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3樓2011-01-14 15:27:15

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hyw1989960

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雙元載體是為了農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)植物用的，如果只是簡單的轉(zhuǎn)到膿桿菌中，根本不需要這樣，常用的轉(zhuǎn)化方法都行，電轉(zhuǎn)化、基因槍都很好轉(zhuǎn)，氯化鈣的當(dāng)然也行，不過好像效率差一些，建議電轉(zhuǎn)化。關(guān)于這方面的百度里很多

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4樓2011-01-14 17:21:38

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姜大磊

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膿桿菌侵染法，和花粉管介導(dǎo)法

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5樓2011-01-14 18:00:13

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6樓2011-01-14 18:02:29

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引用回帖:

Originally posted by 完了 at 2011-01-14 15:27:15:

如果只是一般的克隆用的大腸的質(zhì)粒,那我還需要索要一個(gè)雙元載體吧?否則就要自己構(gòu)建一個(gè)雙元載體?

基本都是拿現(xiàn)成的雙元載體（pBI系列，pCambia系列等等）改造，自己構(gòu)建的話比較復(fù)雜，而且也沒必要。真能搞出一個(gè)好用的載體，光這個(gè)就夠發(fā)文章了

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7樓2011-01-14 18:09:41

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dream-fish

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小木蟲(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖交流

質(zhì)粒轉(zhuǎn)到農(nóng)桿菌用凍融法就好了啊，很快的。感受態(tài)也很好做，去網(wǎng)上搜下農(nóng)桿菌凍融法轉(zhuǎn)化

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8樓2011-01-15 16:06:06

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