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2009227004金蟲 (正式寫手)
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【分享】幾種蛋白質(zhì)定量方法的實際應用 已有6人參與
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幾種蛋白質(zhì)定量方法的實際應用 定量作為生物實驗室的日常工作之一，具有非常重要的意義。在蛋白質(zhì)組學研究中，我們常常需要對蛋白質(zhì)進行快速定量。無論是對蛋白質(zhì)表達譜的定量比較還是蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的分析，都建立在準確的定量這一基礎之上。蛋白質(zhì)的快速定量方法主要依靠蛋白質(zhì)本身的發(fā)色基團，或其與其它顯色劑反應產(chǎn)生的紫外吸收來進行定量。目前常用的主要有直接紫外吸收法、Bradford法和Lorry法三種。 由于DNA具有的5'-磷酸腺嘌呤，5'-磷酸胞密啶和5'-磷酸鳴嘌呤在紫外光譜的260 nm處產(chǎn)生很靈敏的特征峰，我們可以以此對DNA進行定量測定。相似的，由于蛋白質(zhì)中存在著含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，所以任何一個蛋白質(zhì)都具有280nm附近的紫外吸收峰，在此波長范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液的光密度OD280nm與其濃度呈正比關系，我們可以對其進行定量。紫外吸收法測定蛋白質(zhì)含量迅速、簡便、不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測定。因此，已在蛋白質(zhì)和酶的生化制備中廣泛采用，尤其在柱層析分離純化中，常用280nm進行紫外檢測，來判斷蛋白質(zhì)吸附或洗脫情況。但該法存在無法彌補的缺陷。首先，對于測定那些與標準蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異較大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差，故該法適于測定與標準蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。其次，若樣品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物質(zhì)，會出現(xiàn)較大干擾。例如，在制備酶的過程中，層析柱的流出液中有時混雜有核酸，應予以校正。 因此，實驗室一般不采用紫外吸收法，而通常采用改良的Bradford法進行測定蛋白質(zhì)含量。其原理為，蛋白質(zhì)與染料考馬斯亮藍G-250結(jié)合，使得染料最大吸收峰從465nm變?yōu)?95nm，在一定的線性范圍內(nèi)，反應液595nm處吸光度的變化量與反應蛋白量成正比，測定595nm處吸光度的增加即可進行蛋白定量。只需將eppendorf管換為ELISA板并相應的減少各個試劑的用量，這種方法可以應用到大規(guī)模高通量的試驗中，可以同時進行384個樣品的全自動準確定量。 另一種可供選擇的蛋白質(zhì)定量方法為Lorry法。其原理為，蛋白質(zhì)與堿性銅溶液中的Cu2+絡和使得肽鍵伸展，從而使暴露出的酪氨酸和色氨酸在堿性銅條件下與福林試劑反應，產(chǎn)生藍色，在一定濃度范圍內(nèi)，其顏色的深淺與蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸的含量成正比，由于各種蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸的含量各不相同，因此在測定時需使用同種蛋白質(zhì)作標準。Amersham公司將Lorry法進行了改良并商品化。首先用沉淀劑和共沉淀劑沉淀蛋白質(zhì)，這樣可以消除樣品中的色素、尿素和鹽等干擾因素。然后用含Cu2+的復溶劑溶解蛋白質(zhì)，再加入顯色液進行定量。這種方法的優(yōu)點在于定量準確，對各種干擾因素的容忍度都比較高，但是由于引入了沉淀復溶的操作步驟，使得該方法比較耗時，而且容易沉淀復溶不完全，影響結(jié)果的準確性。 縱觀三種蛋白質(zhì)定量方法，各有優(yōu)缺點。紫外吸收法適合于與色譜柱聯(lián)用，達到實時監(jiān)控，然而較不準確。Bradford法適合于大規(guī)模測定樣品，但是樣品中不能含有太高濃度的去污劑，對樣品的要求較高。改良的Lorry法不再排斥去污劑，相對的操作就比較復雜。我們需要在試驗中按照要求選用不同的定量方法。 |
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