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2009227004金蟲 (正式寫手)
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【分享】幾種蛋白質(zhì)定量方法的實(shí)際應(yīng)用 已有6人參與
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幾種蛋白質(zhì)定量方法的實(shí)際應(yīng)用 定量作為生物實(shí)驗(yàn)室的日常工作之一，具有非常重要的意義。在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，我們常常需要對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行快速定量。無論是對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)譜的定量比較還是蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的分析，都建立在準(zhǔn)確的定量這一基礎(chǔ)之上。蛋白質(zhì)的快速定量方法主要依靠蛋白質(zhì)本身的發(fā)色基團(tuán)，或其與其它顯色劑反應(yīng)產(chǎn)生的紫外吸收來進(jìn)行定量。目前常用的主要有直接紫外吸收法、Bradford法和Lorry法三種。 由于DNA具有的5'-磷酸腺嘌呤，5'-磷酸胞密啶和5'-磷酸鳴嘌呤在紫外光譜的260 nm處產(chǎn)生很靈敏的特征峰，我們可以以此對(duì)DNA進(jìn)行定量測(cè)定。相似的，由于蛋白質(zhì)中存在著含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，所以任何一個(gè)蛋白質(zhì)都具有280nm附近的紫外吸收峰，在此波長(zhǎng)范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液的光密度OD280nm與其濃度呈正比關(guān)系，我們可以對(duì)其進(jìn)行定量。紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)含量迅速、簡(jiǎn)便、不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測(cè)定。因此，已在蛋白質(zhì)和酶的生化制備中廣泛采用，尤其在柱層析分離純化中，常用280nm進(jìn)行紫外檢測(cè)，來判斷蛋白質(zhì)吸附或洗脫情況。但該法存在無法彌補(bǔ)的缺陷。首先，對(duì)于測(cè)定那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異較大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差，故該法適于測(cè)定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。其次，若樣品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物質(zhì)，會(huì)出現(xiàn)較大干擾。例如，在制備酶的過程中，層析柱的流出液中有時(shí)混雜有核酸，應(yīng)予以校正。 因此，實(shí)驗(yàn)室一般不采用紫外吸收法，而通常采用改良的Bradford法進(jìn)行測(cè)定蛋白質(zhì)含量。其原理為，蛋白質(zhì)與染料考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合，使得染料最大吸收峰從465nm變?yōu)?95nm，在一定的線性范圍內(nèi)，反應(yīng)液595nm處吸光度的變化量與反應(yīng)蛋白量成正比，測(cè)定595nm處吸光度的增加即可進(jìn)行蛋白定量。只需將eppendorf管換為ELISA板并相應(yīng)的減少各個(gè)試劑的用量，這種方法可以應(yīng)用到大規(guī)模高通量的試驗(yàn)中，可以同時(shí)進(jìn)行384個(gè)樣品的全自動(dòng)準(zhǔn)確定量。 另一種可供選擇的蛋白質(zhì)定量方法為L(zhǎng)orry法。其原理為，蛋白質(zhì)與堿性銅溶液中的Cu2+絡(luò)和使得肽鍵伸展，從而使暴露出的酪氨酸和色氨酸在堿性銅條件下與福林試劑反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)色，在一定濃度范圍內(nèi)，其顏色的深淺與蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸的含量成正比，由于各種蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸的含量各不相同，因此在測(cè)定時(shí)需使用同種蛋白質(zhì)作標(biāo)準(zhǔn)。Amersham公司將Lorry法進(jìn)行了改良并商品化。首先用沉淀劑和共沉淀劑沉淀蛋白質(zhì)，這樣可以消除樣品中的色素、尿素和鹽等干擾因素。然后用含Cu2+的復(fù)溶劑溶解蛋白質(zhì)，再加入顯色液進(jìn)行定量。這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于定量準(zhǔn)確，對(duì)各種干擾因素的容忍度都比較高，但是由于引入了沉淀復(fù)溶的操作步驟，使得該方法比較耗時(shí)，而且容易沉淀復(fù)溶不完全，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。 縱觀三種蛋白質(zhì)定量方法，各有優(yōu)缺點(diǎn)。紫外吸收法適合于與色譜柱聯(lián)用，達(dá)到實(shí)時(shí)監(jiān)控，然而較不準(zhǔn)確。Bradford法適合于大規(guī)模測(cè)定樣品，但是樣品中不能含有太高濃度的去污劑，對(duì)樣品的要求較高。改良的Lorry法不再排斥去污劑，相對(duì)的操作就比較復(fù)雜。我們需要在試驗(yàn)中按照要求選用不同的定量方法。 |
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