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2009227004金蟲 (正式寫手)
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【分享】幾種蛋白質定量方法的實際應用 已有6人參與
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幾種蛋白質定量方法的實際應用 定量作為生物實驗室的日常工作之一，具有非常重要的意義。在蛋白質組學研究中，我們常常需要對蛋白質進行快速定量。無論是對蛋白質表達譜的定量比較還是蛋白質理化性質的分析，都建立在準確的定量這一基礎之上。蛋白質的快速定量方法主要依靠蛋白質本身的發(fā)色基團，或其與其它顯色劑反應產生的紫外吸收來進行定量。目前常用的主要有直接紫外吸收法、Bradford法和Lorry法三種。 由于DNA具有的5'-磷酸腺嘌呤，5'-磷酸胞密啶和5'-磷酸鳴嘌呤在紫外光譜的260 nm處產生很靈敏的特征峰，我們可以以此對DNA進行定量測定。相似的，由于蛋白質中存在著含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，所以任何一個蛋白質都具有280nm附近的紫外吸收峰，在此波長范圍內，蛋白質溶液的光密度OD280nm與其濃度呈正比關系，我們可以對其進行定量。紫外吸收法測定蛋白質含量迅速、簡便、不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測定。因此，已在蛋白質和酶的生化制備中廣泛采用，尤其在柱層析分離純化中，常用280nm進行紫外檢測，來判斷蛋白質吸附或洗脫情況。但該法存在無法彌補的缺陷。首先，對于測定那些與標準蛋白質中酪氨酸和色氨酸含量差異較大的蛋白質，有一定的誤差，故該法適于測定與標準蛋白質氨基酸組成相似的蛋白質。其次，若樣品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物質，會出現(xiàn)較大干擾。例如，在制備酶的過程中，層析柱的流出液中有時混雜有核酸，應予以校正。 因此，實驗室一般不采用紫外吸收法，而通常采用改良的Bradford法進行測定蛋白質含量。其原理為，蛋白質與染料考馬斯亮藍G-250結合，使得染料最大吸收峰從465nm變?yōu)?95nm，在一定的線性范圍內，反應液595nm處吸光度的變化量與反應蛋白量成正比，測定595nm處吸光度的增加即可進行蛋白定量。只需將eppendorf管換為ELISA板并相應的減少各個試劑的用量，這種方法可以應用到大規(guī)模高通量的試驗中，可以同時進行384個樣品的全自動準確定量。 另一種可供選擇的蛋白質定量方法為Lorry法。其原理為，蛋白質與堿性銅溶液中的Cu2+絡和使得肽鍵伸展，從而使暴露出的酪氨酸和色氨酸在堿性銅條件下與福林試劑反應，產生藍色，在一定濃度范圍內，其顏色的深淺與蛋白質中的酪氨酸和色氨酸的含量成正比，由于各種蛋白質中的酪氨酸和色氨酸的含量各不相同，因此在測定時需使用同種蛋白質作標準。Amersham公司將Lorry法進行了改良并商品化。首先用沉淀劑和共沉淀劑沉淀蛋白質，這樣可以消除樣品中的色素、尿素和鹽等干擾因素。然后用含Cu2+的復溶劑溶解蛋白質，再加入顯色液進行定量。這種方法的優(yōu)點在于定量準確，對各種干擾因素的容忍度都比較高，但是由于引入了沉淀復溶的操作步驟，使得該方法比較耗時，而且容易沉淀復溶不完全，影響結果的準確性。 縱觀三種蛋白質定量方法，各有優(yōu)缺點。紫外吸收法適合于與色譜柱聯(lián)用，達到實時監(jiān)控，然而較不準確。Bradford法適合于大規(guī)模測定樣品，但是樣品中不能含有太高濃度的去污劑，對樣品的要求較高。改良的Lorry法不再排斥去污劑，相對的操作就比較復雜。我們需要在試驗中按照要求選用不同的定量方法。 |
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