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xucan0901

銅蟲 (初入文壇)

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[交流] 【求助/交流】為什么測(cè)序和讀碼框都正確的酵母蛋白在大腸中不表達(dá)

我的這個(gè)基因是酵母中的但是沒(méi)有內(nèi)含子，蛋白較大155kDa，
轉(zhuǎn)入表達(dá)兩種表達(dá)質(zhì)粒了，有一種還側(cè)過(guò)序l了。
我做過(guò)好多條件了，溫度從10°到37°，iptg從0.4到1.2mM ,時(shí)間從3h到20h都做過(guò)了，iptg誘導(dǎo)后跑全細(xì)胞電泳感覺(jué)根本沒(méi)有表達(dá)。
后來(lái)聽(tīng)說(shuō)要加甘油試試，我感覺(jué)不靠譜，因?yàn)榧痈视褪菫榱嗽黾幽康牡鞍椎娜芙庑缘�，我的全�?xì)胞都沒(méi)有，就根本沒(méi)有必要考慮溶解性了。
后來(lái)又聽(tīng)說(shuō)稀有密碼子問(wèn)題，叫我換Rosetta（DE3）菌株，這個(gè)我還沒(méi)來(lái)得及做過(guò)不知道值不值得一試。

希望高手指教指教，真的搞奔潰了，同學(xué)做實(shí)驗(yàn)搞兩下就出來(lái)了，我的怎么處處都是坎吶！拜謝了。

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1樓 2011-01-18 22:42:54

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lxj341401

至尊木蟲 (著名寫手)

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dhd997(金幣+2): good 2011-01-19 09:40:02
xucan0901(金幣+1): 2011-01-19 10:12:40

主要是兩個(gè)問(wèn)題，密碼子偏愛(ài)性和蛋白分子量太大。

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3樓2011-01-18 22:57:56

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susizheng

木蟲 (著名寫手)

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dhd997(金幣+2): 有可能吧 2011-01-19 09:39:51
xucan0901(金幣+1): 2011-01-19 10:12:34

是不是蛋白太大了，先問(wèn)問(wèn)有沒(méi)有表達(dá)過(guò)這么大的蛋白的先例。

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2樓2011-01-18 22:49:23

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小蟲子666

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xucan0901(金幣+1): 2011-01-19 10:12:46
xucan0901(金幣+2): 謝謝你，我也想用Rosetta（DE3）試試。 2011-01-19 10:17:30

稀有密碼子多的話 Rosetta（DE3）菌株可以試試，我的是66kda的用普通的BL21做不出來(lái)，Rosetta（DE3）一次就成功了。值得一試

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4樓2011-01-19 09:23:32

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xucan0901

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引用回帖:

Originally posted by susizheng at 2011-01-18 22:49:23:
是不是蛋白太大了，先問(wèn)問(wèn)有沒(méi)有表達(dá)過(guò)這么大的蛋白的先例。

我問(wèn)過(guò)其他的博士師兄，他說(shuō)他們實(shí)驗(yàn)室表達(dá)過(guò)比這大的多的蛋白。
應(yīng)該不是蛋白太大的原因。

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5樓2011-01-19 10:20:41

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