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[交流] 【求助/交流】連接轉(zhuǎn)化-好難

最近做一個(gè)載體的構(gòu)建，最后一個(gè)片段連接，做了不下10次了，依然沒(méi)有結(jié)果。
現(xiàn)在嚴(yán)重懷疑自己的實(shí)驗(yàn)技能和人品。
請(qǐng)大家?guī)兔Α?br /> 我的載體和DNA片段酶切位點(diǎn)為SacII和NotI，不知道是不是這兩個(gè)酶有什么不同？
或者膠回收試劑盒的問(wèn)題？
或者連接酶的問(wèn)題？
再或者感受態(tài)細(xì)胞的問(wèn)題?
現(xiàn)在搞得我對(duì)什么都懷疑，但是以前都用這套體系是可以出來(lái)的。
好糾結(jié)... ...

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1樓 2011-02-26 12:45:40

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hzkui602

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如果懷疑這些東西，那就一步步檢測(cè)嗎！

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2樓2011-02-26 12:54:32

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brightfuture01

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lstt09nk(金幣+2): 感謝參與 2011-02-26 13:35:30
runze116(金幣+1): 2011-03-01 08:11:22

每一步都將對(duì)照做好了，一步步排除。

比如實(shí)驗(yàn)室其他人最近做成功過(guò)，那么證明感受態(tài)是沒(méi)有問(wèn)題的。

如果人家也是用的你的那兩個(gè)酶，那證明酶也是沒(méi)有問(wèn)題的。

換個(gè)人幫你做一次。。。。。。

有的時(shí)候還真可能是RP問(wèn)題，

，開(kāi)玩笑的，每個(gè)人的操作可能有差異罷了。

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3樓2011-02-26 13:01:09

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三磷酸腺苷

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lstt09nk(金幣+1): 鼓勵(lì)交流 2011-02-26 13:35:40

能把你連接轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)方法發(fā)上來(lái)嗎？大家一起看看有什么問(wèn)題
涉及的酶要把廠家寫(xiě)上來(lái)

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4樓2011-02-26 13:12:19

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上面兩位專(zhuān)家，人家只是抱怨一下，不用這么認(rèn)真

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5樓2011-02-26 13:55:55

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wangyeliu

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注意細(xì)節(jié)和關(guān)鍵步驟

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6樓2011-02-26 14:15:43

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天使托

無(wú)蟲(chóng)

★ ★
lstt09nk(金幣+2): 熱心蟲(chóng)友，歡迎多多交流~~ 2011-02-28 09:36:19
runze116(金幣+1): 2011-03-01 08:11:12

連接一般情況比較好做！
1：感受態(tài)細(xì)胞要好，效率要高，即便你的重組載體構(gòu)建好了，細(xì)胞不好，依然不會(huì)有結(jié)果！
2：連接的時(shí)候DNA片段和質(zhì)粒的比例要適當(dāng)，一般DNA多一些；
3：連接時(shí)間稍微長(zhǎng)一些，當(dāng)然了假陽(yáng)性會(huì)有，但是我覺(jué)得吧時(shí)間長(zhǎng)一些對(duì)于不太好連的DNA片段好一些！、

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7樓2011-02-26 14:16:33

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runze116(金幣+1): 2011-03-01 08:11:51

你說(shuō)的沒(méi)有結(jié)果，是指什么結(jié)果？連接不成功還是連接后鑒定不對(duì)？還是什么其他的……………………

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8樓2011-02-26 16:15:43

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zhangxn2010

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lstt09nk(金幣+1): 鼓勵(lì)交流 2011-02-28 09:36:37
runze116(金幣+5): 2011-03-01 08:11:00

有人說(shuō)連接放在4℃，連接時(shí)間為48h會(huì)提高連接效率；
感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率通過(guò)某特定質(zhì)粒來(lái)計(jì)算；
然后再積累RP；
靜等結(jié)果出現(xiàn)

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9樓2011-02-26 22:46:52

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zhouxj

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經(jīng)驗(yàn)，請(qǐng)教成功的

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10樓2011-02-27 23:42:44

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power103

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lstt09nk(金幣+5): 鼓勵(lì)新蟲(chóng)交流~ 2011-02-28 09:37:03
runze116(金幣+1): 用的就是NEB的酶 2011-03-01 08:12:16

可能酶切體系不對(duì)，你好好查查酶公司protocol。建議你用NEB的酶。
如果還不行的話，把轉(zhuǎn)化量加大，不要離心了直接涂板子。

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11樓2011-02-28 00:10:04

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runze116(金幣+1): 謝謝提醒 2011-03-01 08:12:38

建議先將片段和載體跑膠看是否回收出來(lái)了呢，選擇連接加入載體和片段后，再加水，放到65度溫育10分鐘，中間彈幾次，將粘性末端自身的搭配打開(kāi)，放入冰上2分鐘，再加入酶的buffer，和連接酶，轉(zhuǎn)化時(shí)選擇購(gòu)買(mǎi)的感受態(tài)細(xì)胞。

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12樓2011-02-28 13:06:51

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★
小木蟲(chóng)(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖交流

如果你確定protocol不錯(cuò)的話，可以用另一個(gè)帶有你用的那兩個(gè)酶的酶切位點(diǎn)的質(zhì)粒做一下對(duì)照，如果能切下來(lái)，說(shuō)明你的質(zhì)粒用問(wèn)題，建議你測(cè)一下序去。

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13樓2011-03-02 23:25:01

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我也是，怎么辦

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14樓2018-03-27 14:46:37

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一米吃蘋(píng)果

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換個(gè)人幫你做

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15樓2018-03-27 15:41:35

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