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nestzhao

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[交流] 【求助/交流】有使用過λDE3溶源化試劑盒的進(jìn)來看看...

有沒有人用過λDE3 lysogenization kit制備過溶源化菌的

求教一下，需要注意點(diǎn)什么啊

做了幾次一直沒有成功

很郁悶
.....

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1樓 2011-03-15 09:53:18

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susizheng

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nestzhao(金幣+3): 2011-03-16 21:04:26
rainwander(金幣+3): 鼓勵(lì)分享自己的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)~不錯(cuò) 2011-03-16 22:38:46

引用回帖:

Originally posted by nestzhao at 2011-03-16 09:58:09:
我用的是Novagen公司提供的試劑盒

我按照他的說明，在溶源化這個(gè)過程中就是沒有看到噬菌斑

我就試著挑了平板上的單菌落進(jìn)行溶源化驗(yàn)證也沒有出現(xiàn)噬菌斑

所以就很奇怪

我找了下實(shí)驗(yàn)記錄，
我的步驟是，OD長(zhǎng)到0.5左右后，
3）取1uL菌液與1 uL ƛDE3 phage lysate，3.3 ul helper phage lysate，1 uL selection phage lysate于37 ℃水浴30 min。（由于所取三種裂解液量較少，可事先取一定體積的三種裂解液混勻，使用時(shí)取所需的量）
4）加入100 uL的LB培養(yǎng)基稀釋后梯度涂布LB平板，37 ℃培養(yǎng)過夜
一般10 uL菌液能長(zhǎng)出比較適合的菌落數(shù)。菌落長(zhǎng)得少打點(diǎn)，你就可以看到未溶原化的菌落出現(xiàn)噬菌斑，溶原化成功的菌落就比較圓滑。

你如果完全按照說明書做，肯定長(zhǎng)得密密麻麻，看不到噬菌斑。

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6樓2011-03-16 14:09:00

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susizheng

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nestzhao(金幣+1): 2011-03-15 17:43:18
rainwander(金幣+2): 鼓勵(lì)積極參與交流~~~ 2011-03-15 23:37:03

由于幾種Lysate的使用量都很少，建議先取大一點(diǎn)的體積混勻后，再取要使用的量。
沒成功是個(gè)什么情況？是全部出現(xiàn)噬菌斑了，還是都沒出現(xiàn)噬菌斑。
建議還是買公司的溶原菌吧，即使成功了，效果也不是很好的。

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2樓2011-03-15 11:02:14

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引用回帖:

Originally posted by susizheng at 2011-03-15 11:02:14:
由于幾種Lysate的使用量都很少，建議先取大一點(diǎn)的體積混勻后，再取要使用的量。
沒成功是個(gè)什么情況？是全部出現(xiàn)噬菌斑了，還是都沒出現(xiàn)噬菌斑。
建議還是買公司的溶原菌吧，即使成功了，效果也不是很好的。

首先按照說明書要求，將目的菌培養(yǎng)到OD600=0.5 ，然后取了按照他要求的濃度做了梯度，涂布及培養(yǎng)后，長(zhǎng)出的菌落遠(yuǎn)大于他所要求的50-200個(gè)
挑單菌落培養(yǎng)后驗(yàn)證，沒有出現(xiàn)噬菌斑，而且是他提供的陽(yáng)性對(duì)照株也沒有出現(xiàn)噬菌斑，而我用實(shí)驗(yàn)室原來就有的的BL21（DE3）做的對(duì)照出現(xiàn)了噬菌斑

我也不知道原因出在哪兒了

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3樓2011-03-15 17:47:28

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nestzhao(金幣+1): 2011-03-16 09:27:03

引用回帖:

Originally posted by nestzhao at 2011-03-15 17:47:28:
首先按照說明書要求，將目的菌培養(yǎng)到OD600=0.5 ，然后取了按照他要求的濃度做了梯度，涂布及培養(yǎng)后，長(zhǎng)出的菌落遠(yuǎn)大于他所要求的50-200個(gè)
挑單菌落培養(yǎng)后驗(yàn)證，沒有出現(xiàn)噬菌斑，而且是他提供的陽(yáng)性對(duì)照株 ...

那你用的是哪個(gè)公司的試劑盒，我看看，不是涂布板子的時(shí)候就能看到噬菌斑嗎？挑單菌落干啥？

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4樓2011-03-15 22:13:14

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