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6207220新蟲(chóng) (初入文壇)
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[交流]
【求助/交流】現(xiàn)要設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增后測(cè)序，無(wú)各個(gè)條件都滿(mǎn)足的引物，請(qǐng)問(wèn)什么條件是最重? 已有2人參與
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是這樣的 本人純新手 現(xiàn)要補(bǔ)齊DNA全長(zhǎng) PCR擴(kuò)增后直接測(cè)序 用PP5搜索不到比較好的引物  滿(mǎn)足了這個(gè)滿(mǎn)足不了那個(gè) 那么在引物設(shè)計(jì)原則里面 什么是比較重要的 引物長(zhǎng)度 形成二聚體 發(fā)夾結(jié)構(gòu)的△G等等？ 還有一個(gè)問(wèn)題。。為什么我有時(shí)輸?shù)絇P5里面搜索 同樣一段序列 同樣的設(shè)置 但是搜索結(jié)果不一樣啊 太憂傷了。。 |
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amilie030312
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1949stone(金幣+2): 鼓勵(lì) 2011-03-21 15:04:15
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別那么糾結(jié)，要是已知序列就在要擴(kuò)的兩端截一段，用引物計(jì)算器算一下，別太不靠譜就可以了，個(gè)人認(rèn)為如果要求不高的話，二聚體可以切膠去掉，發(fā)卡結(jié)構(gòu)調(diào)PCR的溫度就可以，長(zhǎng)度17到25就行。 如果你要做DNA全長(zhǎng)，可能片段比較大吧，這可能就需要用一些長(zhǎng)片段的酶了，或者看GC含量高不高，看酶是否耐受高GC，另外后續(xù)要測(cè)序，酶就需要用高保真的酶了。 |
2樓2011-03-21 12:46:16
6207220
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3樓2011-03-21 13:11:21
豆豆魚(yú)
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4樓2011-03-21 19:14:50
amilie030312
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| 連接不上有很多種情況，首先想到的是連接酶的問(wèn)題，如果連接酶沒(méi)有問(wèn)題那么看片段末端是不是有啥情況。比如擴(kuò)增后是否進(jìn)行了酶切，酶切之后末端是突出端還是平端，都可以根據(jù)情況選擇不同的辦法，另外，如果切了看內(nèi)切酶是不是有污染把突出端的幾個(gè)堿基切掉了導(dǎo)致再連連不上了。又或者你PCR之后產(chǎn)物放在冰箱里時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，產(chǎn)物發(fā)生自連了那就先65度5分鐘退火一下，總之做生物實(shí)驗(yàn)小問(wèn)題多多，在每一步里面好好注意一下就好啦。 |
5樓2011-03-31 13:47:12
6207220
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6樓2011-03-31 22:23:03
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