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生興生物銀蟲(chóng) (小有名氣)
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【專題】細(xì)胞活力檢測(cè)------MTT比色法 已有2人參與
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Q：細(xì)胞活力檢測(cè)中，MTT比色法的原理？ A：活細(xì)胞中的脫氫酶能將MTT還原成不溶于水的藍(lán)紫色產(chǎn)物（甲臜，F(xiàn)ormazan)，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒(méi)有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細(xì)胞中的藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的Formazan量成正比，最后用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值。 Q：MTT比色法細(xì)胞活力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中有哪些注意事項(xiàng)？ A：（1）選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度。一般情況下，96孔培養(yǎng)板的內(nèi)貼壁細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)約有l(wèi)o6個(gè)細(xì)胞。但由于不同細(xì)胞貼壁后面積差異很大，因此，在進(jìn)行MTT比色法細(xì)胞活力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)前，掌握每一種細(xì)胞的貼壁率、倍增時(shí)間以及不同接種細(xì)胞數(shù)條件下的生長(zhǎng)曲線，確定實(shí)驗(yàn)中每孔的接種細(xì)胞數(shù)和培養(yǎng)時(shí)間，以保證培養(yǎng)終止致細(xì)胞過(guò)滿。這樣，才能保證形成酌量的MTT結(jié)晶，與細(xì)胞數(shù)量呈線性關(guān)系。 （2）避免血清干擾。用含15%胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，高濃度的血清物質(zhì)會(huì)影響實(shí)驗(yàn)孔的光吸收值。由于實(shí)驗(yàn)本底增加，會(huì)使實(shí)驗(yàn)敏感。因此，一般選擇濃度小于10%胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行。在呈色后，盡量吸凈培養(yǎng)孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。 3）設(shè)空白對(duì)照。與實(shí)驗(yàn)孔平行設(shè)不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白孔。其它實(shí)驗(yàn)步驟保持一致。最后比色時(shí)，以空白孔調(diào)零。 Q：MTT比色法細(xì)胞活力檢測(cè)染色后，96孔板中的上清棄去后是否要用PBS洗一下再加二甲亞砜？ A：不必洗，MTT與Fomazan的顏色不同，吸光譜也不同，實(shí)際上測(cè)的是OD570的吸收光，實(shí)際MTT的吸光度在此波長(zhǎng)很小。Fomazan對(duì)細(xì)胞是有害的，部分細(xì)胞死掉后，F(xiàn)ormazan結(jié)晶在其周圍，如果清洗就丟失了。 Q：MTT比色法細(xì)胞活力檢測(cè)中對(duì)照設(shè)置很重要嗎？ A： MTT比色法細(xì)胞活力檢測(cè)中最重要的就是背景對(duì)照，就是不加細(xì)胞的對(duì)照。這包括兩方面內(nèi)容，一是指與實(shí)驗(yàn)孔相同，對(duì)照孔中也加入相同體積的培養(yǎng)基，各做3-4個(gè)復(fù)孔，取平均值，主要目的是為了減少培養(yǎng)基中含有的酚紅對(duì)比色的影響；二是要在對(duì)照孔內(nèi)加入與實(shí)驗(yàn)孔相同成分和濃度的藥物（特別是藥物pH值為酸性或堿性時(shí)），同樣也是為了減少比色時(shí)的誤差。 Q：如何解決酶標(biāo)儀測(cè)出的數(shù)據(jù)總是不穩(wěn)定、重復(fù)性差的問(wèn)題？A：加樣CV控制在5%以內(nèi)； 防止細(xì)胞丟失； 充分震蕩，溶解甲臢； OD值盡量控制在0.3-0.6之間； 做空白對(duì)照。 Q：如何讓二甲亞砜溶解充分？ A：如果細(xì)胞是貼壁生長(zhǎng)的，吸棄上清液后，每孔加入150 μl 二甲亞砜，振蕩10 min；如果是懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞，需離心（1000 rpm，5 min），然后棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液后再加二甲亞砜。 Q：MTT法細(xì)胞活力檢測(cè)細(xì)胞活力時(shí)，如何確定加藥物的時(shí)間？A：一般文獻(xiàn)報(bào)道的方法，是貼壁細(xì)胞在細(xì)胞貼壁后加藥物（一般為上板后24h），而懸浮細(xì)胞是上板同時(shí)加。 但是，在操作中具體要根據(jù)實(shí)驗(yàn)本身要檢測(cè)的指標(biāo)來(lái)確定時(shí)間。如果是做有關(guān)細(xì)胞增殖的藥物，加藥的時(shí)機(jī)影響不大，主要是藥物的作用時(shí)間起決定性因素；如果要檢測(cè)的是其他一些指標(biāo)（比如藥物對(duì)細(xì)胞黏附功能的影響），就要在細(xì)胞貼壁以前加藥了 Q：MTT法細(xì)胞活力檢測(cè)貼壁細(xì)胞活力時(shí)，如何確定細(xì)胞接種到96孔板的時(shí)間？ A：貼壁細(xì)胞一般在實(shí)驗(yàn)前1-2日接入96孔板。太晚，細(xì)胞在傳代后有一個(gè)16小時(shí)左右的停滯期，此時(shí)代謝變慢，增殖緩慢，此時(shí)的MTT數(shù)值太低；太早，實(shí)驗(yàn)期間，細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)頭，此時(shí)有死亡和凋亡的細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)時(shí)本底又過(guò)高，應(yīng)該尋求的效果是實(shí)驗(yàn)時(shí)落在細(xì)胞對(duì)數(shù)早中期最好。 |
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