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MTT法檢測(cè)hegf生長(zhǎng)因子活性系列問題求助
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最近實(shí)驗(yàn)一直在做MTT實(shí)驗(yàn)，注意不是毒理性實(shí)驗(yàn)，是檢測(cè)藥物（hegf人表皮生長(zhǎng)因子）活性實(shí)驗(yàn)，hegf可促進(jìn)成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)，通過MTT測(cè)定檢測(cè)其促細(xì)胞生長(zhǎng)的能力，即hegf的活性。我的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和基本方法如下： 1.使用細(xì)胞為：Balb/c3T3小鼠成纖維細(xì)胞 2.培養(yǎng)基為DMEM和FBS ，但藥典方法使用的是R1640和CS，這兩個(gè)組合我都進(jìn)行過實(shí)驗(yàn)，結(jié)果都是不理想。 3.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下： 類別 種板細(xì)胞數(shù) 設(shè)置復(fù)孔數(shù)/個(gè) 濃度梯度（4倍稀釋）/個(gè) hegf標(biāo)準(zhǔn)品 5000個(gè)/孔 3 8 hegf樣品 5000個(gè)/孔 3 8 陽(yáng)性對(duì)照 5000個(gè)/孔 3 無(wú) 陰性對(duì)照 5000個(gè)/孔 3 無(wú) 空白對(duì)照 無(wú) 6 無(wú) 注：維持培養(yǎng)基為加入0.4%的血清，完全培養(yǎng)基是加入10%的血清。 5.培養(yǎng)時(shí)間和條件都與藥典方法一致。 經(jīng)過一段時(shí)間的摸索，現(xiàn)有如下問題，有經(jīng)驗(yàn)的朋友一定要多指教，謝謝！ 1.陰性對(duì)照組的結(jié)果比標(biāo)準(zhǔn)品組和樣品組的結(jié)果要好，但比陽(yáng)性對(duì)照差。（理想的結(jié)果是陽(yáng)性對(duì)照組是最好，標(biāo)準(zhǔn)品組和樣品組次之，陰性對(duì)照組是最差。） 2.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平行性非常差，在加入MTT孵育4h后，在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)復(fù)孔的平行性非常差（MTT只對(duì)活細(xì)胞有作用，與琥珀酸脫氫酶反應(yīng)后產(chǎn)生紫色結(jié)晶，所以在顯微鏡下觀察，可以明顯看到結(jié)晶的量多少），個(gè)別孔的紫色結(jié)晶量非常少，有些孔又很多。這個(gè)問題是不是跟細(xì)胞的狀態(tài)有關(guān)，在培養(yǎng)過程中，細(xì)胞生長(zhǎng)和死亡率不一致，導(dǎo)致平行性非常差。 3.酶標(biāo)儀波長(zhǎng)和震蕩時(shí)間的問題：藥典使用的波長(zhǎng)是以630nm為參考波長(zhǎng)，570nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，由于實(shí)驗(yàn)室沒有條件，我們使用的是490nm的波長(zhǎng)檢測(cè)，在網(wǎng)上看了相關(guān)資料，有些朋友說490nm的波長(zhǎng)也可以使用，靈敏度也不錯(cuò)，不知道是否可行。 現(xiàn)在我們實(shí)驗(yàn)在酶標(biāo)儀的震蕩時(shí)間設(shè)置為30秒 強(qiáng)震蕩。震蕩的目的是為了使紫色結(jié)晶溶解更充分，能不能設(shè)置震蕩時(shí)間越長(zhǎng)越好呢？時(shí)間過長(zhǎng)也會(huì)影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)么？目前我們?cè)O(shè)定的時(shí)間和震蕩強(qiáng)度是不是合理的呢，有經(jīng)驗(yàn)的朋友給些建議吧。 4.培養(yǎng)基PH值的問題：我們使用R1640干粉培養(yǎng)基配制，配制過程按照說明書進(jìn)行，調(diào)節(jié)PH值7.0，過濾后PH值為7.48或者7.47， 而細(xì)胞培養(yǎng)基的PH值為7.2-7.4，略高的PH值對(duì)細(xì)胞影響大不大？如果重新調(diào)整PH值后，再進(jìn)行過濾，配制的R1640還能繼續(xù)使用嗎？DMEM培養(yǎng)基我們是直接購(gòu)買GIBCO的，不需要配制，但在使用一段時(shí)間后發(fā)現(xiàn)其PH值升到8以上，這樣的培養(yǎng)基還能繼續(xù)使用么？ 有些朋友說，可以通入無(wú)菌的二氧化碳?xì)怏w調(diào)節(jié)PH值，但是我們實(shí)驗(yàn)室沒有這樣的條件，是否可以使用1N的HCL調(diào)節(jié)，然后過濾？還有些朋友說可以擰松蓋子放到通有二氧化碳的培養(yǎng)箱內(nèi)放置一段時(shí)間，PH就會(huì)下降，這樣的操作可行嗎？ 有什么方法可以很好的保存培養(yǎng)基，維持PH值恒定？ 注：我們的培養(yǎng)基都是放在4度冰箱保存。 5.DMSO的問題：看到資料說進(jìn)行細(xì)胞凍存，一段要使用特定的DMSO,如Sigma D2650) ，我們使用的是sigma的DMSO，但是型號(hào)好像不是這個(gè)，不知道行不行？MTT實(shí)驗(yàn)使用的DMSO也是sigma的，有些人可能是使用國(guó)產(chǎn)的吧。 暫時(shí)想到這么多問題，后續(xù)有問題再補(bǔ)充吧。 |
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6樓2011-09-27 08:27:50
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luolh2004(金幣+15): 謝謝回帖 ，給你追加了15個(gè)BB 2011-10-10 13:35:42
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EGF活性的測(cè)定，個(gè)人認(rèn)為鋪板是比較關(guān)鍵的，當(dāng)然前提是保證細(xì)胞狀態(tài)良好。細(xì)胞的消化時(shí)間，細(xì)胞計(jì)數(shù)，吹打是否均勻，孔中細(xì)胞是否分布均勻都是影響因素 培養(yǎng)基的pH問題，根據(jù)1640的配制說明，是要加入NaHCO3的（記得好像是每升加入3.0g），配制用水我們用的是超純水，用0.1mol/ml的鹽酸（滅菌處理）調(diào)節(jié)pH，過濾除菌，配制完成后放在4℃冰箱里保存。樓主不在二氧化碳培養(yǎng)箱里培養(yǎng)細(xì)胞嗎？ 細(xì)胞凍存一般會(huì)選擇sigma細(xì)胞級(jí)的DMSO，檢測(cè)時(shí)用國(guó)產(chǎn)普通的DMSO是沒什么問題的 [ Last edited by liyangmiscap on 2011-10-10 at 10:41 ] |
11樓2011-10-10 10:39:41
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luolh2004(金幣+10): 謝謝回帖交流 2011-09-24 19:24:12
lstt09nk(金幣+5): 鼓勵(lì)下 2011-09-25 12:46:56
silicare(BioEPI+1): 2011-09-27 17:04:39
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silicare(BioEPI+1): 2011-09-27 17:04:39
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樓主做MTT只做一次還是每天都做呢？ 比如我們的實(shí)驗(yàn)都是這樣的：同一個(gè)劑量組，做8個(gè)孔，每天拿一個(gè)孔來進(jìn)行測(cè)量，連續(xù)做8天。同時(shí)做3個(gè)復(fù)孔。做一組生長(zhǎng)曲線，通過生長(zhǎng)曲線來比較效果。 我們是振蕩10S 1640是加過碳酸氫鈉的么？如果是加過的，放一段時(shí)間PH升高是因?yàn)樘妓釟溻c變?yōu)樘妓徕c了，你放入高二氧化碳的培養(yǎng)箱里，二氧化碳可以溶入培養(yǎng)基，又生成碳酸氫鈉，可以回復(fù)到你調(diào)節(jié)PH時(shí)的PH值。培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)用二氧化碳培養(yǎng)箱就是這個(gè)作用。 DMSO影響應(yīng)該不大，我們用的也是SIGAMA的。 |
2樓2011-09-24 17:25:07
3樓2011-09-24 19:27:18
5樓2011-09-26 10:26:07
7樓2011-09-27 14:30:08
8樓2011-09-28 08:33:33
9樓2011-09-29 18:01:25
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adslye(金幣+2): 鼓勵(lì)交流~ 2011-10-09 16:14:08
luolh2004(金幣+86): 看到?jīng)]有人回答 你的建議也挺好的 金幣都發(fā)給你吧 2011-10-09 17:35:13
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| 做細(xì)胞生長(zhǎng)因子活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞狀態(tài)很重要，有的時(shí)候?yàn)榱苏疹櫳习鄷r(shí)間而匆忙種板，其實(shí)細(xì)胞細(xì)目還很少，大概只有覆蓋了培養(yǎng)皿的20-30%，按照細(xì)胞生長(zhǎng)周期來看只是處在貼壁期，而實(shí)驗(yàn)時(shí)的細(xì)胞以處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為佳，因?yàn)檫@個(gè)時(shí)期的細(xì)胞種板后死細(xì)胞較少，加入因子后細(xì)胞狀態(tài)良好，無(wú)論是促進(jìn)還是抑制，細(xì)胞不至于大面積死亡。 |
10樓2011-10-09 14:29:40
12樓2011-10-10 13:34:20
13樓2011-10-10 15:35:33
14樓2011-10-10 15:36:57
15樓2011-10-12 11:37:57
telomerase
至尊木蟲 (著名寫手)
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小木蟲(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖
luolh2004(金幣+20): 太好了 ，真不容易，能發(fā)現(xiàn)有人做一樣的實(shí)驗(yàn)，一定要多交流 2011-10-14 12:40:26
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luolh2004(金幣+20): 太好了 ，真不容易，能發(fā)現(xiàn)有人做一樣的實(shí)驗(yàn)，一定要多交流 2011-10-14 12:40:26
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之前在化妝品公司做的就是這個(gè)，標(biāo)準(zhǔn)品用的暨南大學(xué)的egf，也用的3T3細(xì)胞 看你的結(jié)論覺得你的鋪板是有問題，復(fù)孔的結(jié)果太差，用排槍會(huì)好些 關(guān)于培養(yǎng)基PH的問題可以加HEPES來解決，1L 3g吧差不多 DMSO我個(gè)人覺得不是個(gè)事 上酶標(biāo)儀前，甩板小心點(diǎn)，甩不干凈就到扣在吸水紙上，讓他流盡 [ Last edited by telomerase on 2011-10-12 at 12:05 ] |
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17樓2011-10-14 12:41:10
18樓2016-02-26 17:20:21
19樓2016-02-29 15:56:21
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
送紅花一朵
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謝謝您的回答！我還有一個(gè)問題想請(qǐng)教您，我的實(shí)驗(yàn)是用PC12細(xì)胞做的，PC12培養(yǎng)基配方中含10%的馬血清和5%的胎牛血清，藥典中沒有使用這種細(xì)胞的，想請(qǐng)教您用四參數(shù)法測(cè)活性單位的話，這種情況的血清濃度應(yīng)該減為多少呢？ 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
20樓2016-03-01 11:10:59
21樓2016-03-01 14:07:21
22樓2016-09-20 11:39:07
23樓2017-08-03 21:07:02
簡(jiǎn)單回復(fù)
莫道銷魂XF4樓
2011-09-26 10:17
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luolh2004(金幣+2): 多謝支持 請(qǐng)給些建議唄 2011-09-26 20:08:14
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[考研] 375求調(diào)劑 +7 | 雨夏整夜 2026-03-29 | 7/350 |
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[考研] 本2一志愿C9-333分，材料科學(xué)與工程，求調(diào)劑 +9 | 升升不降 2026-03-31 | 9/450 |
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[考研] 一志愿西電085401數(shù)一英一299求調(diào)劑 六級(jí)521 +4 | 愛吃大鴨梨 2026-03-31 | 4/200 |
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[考博] 材料專業(yè)申博 +5 | 杜雨婷dyt 2026-03-29 | 5/250 |
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[考研] 福建理工大學(xué)材料學(xué)院先進(jìn)合金團(tuán)隊(duì)招收考研調(diào)劑學(xué)生 +3 | 大華金商都 2026-03-30 | 4/200 |
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[考研] 285求調(diào)劑 +6 | AZMK 2026-03-29 | 9/450 |
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[考研] 332求92調(diào)劑 +8 | 蕉蕉123 2026-03-28 | 8/400 |
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[考研] 本科新能源科學(xué)與工程，一志愿華理能動(dòng)285求調(diào)劑 +3 | AZMK 2026-03-27 | 5/250 |
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