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MTT法檢測(cè)hegf生長(zhǎng)因子活性系列問(wèn)題求助
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最近實(shí)驗(yàn)一直在做MTT實(shí)驗(yàn)，注意不是毒理性實(shí)驗(yàn)，是檢測(cè)藥物（hegf人表皮生長(zhǎng)因子）活性實(shí)驗(yàn)，hegf可促進(jìn)成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)，通過(guò)MTT測(cè)定檢測(cè)其促細(xì)胞生長(zhǎng)的能力，即hegf的活性。我的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和基本方法如下： 1.使用細(xì)胞為：Balb/c3T3小鼠成纖維細(xì)胞 2.培養(yǎng)基為DMEM和FBS ，但藥典方法使用的是R1640和CS，這兩個(gè)組合我都進(jìn)行過(guò)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果都是不理想。 3.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下： 類別 種板細(xì)胞數(shù) 設(shè)置復(fù)孔數(shù)/個(gè) 濃度梯度（4倍稀釋）/個(gè) hegf標(biāo)準(zhǔn)品 5000個(gè)/孔 3 8 hegf樣品 5000個(gè)/孔 3 8 陽(yáng)性對(duì)照 5000個(gè)/孔 3 無(wú) 陰性對(duì)照 5000個(gè)/孔 3 無(wú) 空白對(duì)照 無(wú) 6 無(wú) 注：維持培養(yǎng)基為加入0.4%的血清，完全培養(yǎng)基是加入10%的血清。 5.培養(yǎng)時(shí)間和條件都與藥典方法一致。 經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的摸索，現(xiàn)有如下問(wèn)題，有經(jīng)驗(yàn)的朋友一定要多指教，謝謝！ 1.陰性對(duì)照組的結(jié)果比標(biāo)準(zhǔn)品組和樣品組的結(jié)果要好，但比陽(yáng)性對(duì)照差。（理想的結(jié)果是陽(yáng)性對(duì)照組是最好，標(biāo)準(zhǔn)品組和樣品組次之，陰性對(duì)照組是最差。） 2.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平行性非常差，在加入MTT孵育4h后，在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)復(fù)孔的平行性非常差（MTT只對(duì)活細(xì)胞有作用，與琥珀酸脫氫酶反應(yīng)后產(chǎn)生紫色結(jié)晶，所以在顯微鏡下觀察，可以明顯看到結(jié)晶的量多少），個(gè)別孔的紫色結(jié)晶量非常少，有些孔又很多。這個(gè)問(wèn)題是不是跟細(xì)胞的狀態(tài)有關(guān)，在培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞生長(zhǎng)和死亡率不一致，導(dǎo)致平行性非常差。 3.酶標(biāo)儀波長(zhǎng)和震蕩時(shí)間的問(wèn)題：藥典使用的波長(zhǎng)是以630nm為參考波長(zhǎng)，570nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，由于實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有條件，我們使用的是490nm的波長(zhǎng)檢測(cè)，在網(wǎng)上看了相關(guān)資料，有些朋友說(shuō)490nm的波長(zhǎng)也可以使用，靈敏度也不錯(cuò)，不知道是否可行。 現(xiàn)在我們實(shí)驗(yàn)在酶標(biāo)儀的震蕩時(shí)間設(shè)置為30秒 強(qiáng)震蕩。震蕩的目的是為了使紫色結(jié)晶溶解更充分，能不能設(shè)置震蕩時(shí)間越長(zhǎng)越好呢？時(shí)間過(guò)長(zhǎng)也會(huì)影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)么？目前我們?cè)O(shè)定的時(shí)間和震蕩強(qiáng)度是不是合理的呢，有經(jīng)驗(yàn)的朋友給些建議吧。 4.培養(yǎng)基PH值的問(wèn)題：我們使用R1640干粉培養(yǎng)基配制，配制過(guò)程按照說(shuō)明書進(jìn)行，調(diào)節(jié)PH值7.0，過(guò)濾后PH值為7.48或者7.47， 而細(xì)胞培養(yǎng)基的PH值為7.2-7.4，略高的PH值對(duì)細(xì)胞影響大不大？如果重新調(diào)整PH值后，再進(jìn)行過(guò)濾，配制的R1640還能繼續(xù)使用嗎？DMEM培養(yǎng)基我們是直接購(gòu)買GIBCO的，不需要配制，但在使用一段時(shí)間后發(fā)現(xiàn)其PH值升到8以上，這樣的培養(yǎng)基還能繼續(xù)使用么？ 有些朋友說(shuō)，可以通入無(wú)菌的二氧化碳?xì)怏w調(diào)節(jié)PH值，但是我們實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有這樣的條件，是否可以使用1N的HCL調(diào)節(jié)，然后過(guò)濾？還有些朋友說(shuō)可以擰松蓋子放到通有二氧化碳的培養(yǎng)箱內(nèi)放置一段時(shí)間，PH就會(huì)下降，這樣的操作可行嗎？ 有什么方法可以很好的保存培養(yǎng)基，維持PH值恒定？ 注：我們的培養(yǎng)基都是放在4度冰箱保存。 5.DMSO的問(wèn)題：看到資料說(shuō)進(jìn)行細(xì)胞凍存，一段要使用特定的DMSO,如Sigma D2650) ，我們使用的是sigma的DMSO，但是型號(hào)好像不是這個(gè)，不知道行不行？MTT實(shí)驗(yàn)使用的DMSO也是sigma的，有些人可能是使用國(guó)產(chǎn)的吧。 暫時(shí)想到這么多問(wèn)題，后續(xù)有問(wèn)題再補(bǔ)充吧。 |
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7樓2011-09-27 14:30:08
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luolh2004(金幣+10): 謝謝回帖交流 2011-09-24 19:24:12
lstt09nk(金幣+5): 鼓勵(lì)下 2011-09-25 12:46:56
silicare(BioEPI+1): 2011-09-27 17:04:39
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silicare(BioEPI+1): 2011-09-27 17:04:39
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樓主做MTT只做一次還是每天都做呢？ 比如我們的實(shí)驗(yàn)都是這樣的：同一個(gè)劑量組，做8個(gè)孔，每天拿一個(gè)孔來(lái)進(jìn)行測(cè)量，連續(xù)做8天。同時(shí)做3個(gè)復(fù)孔。做一組生長(zhǎng)曲線，通過(guò)生長(zhǎng)曲線來(lái)比較效果。 我們是振蕩10S 1640是加過(guò)碳酸氫鈉的么？如果是加過(guò)的，放一段時(shí)間PH升高是因?yàn)樘妓釟溻c變?yōu)樘妓徕c了，你放入高二氧化碳的培養(yǎng)箱里，二氧化碳可以溶入培養(yǎng)基，又生成碳酸氫鈉，可以回復(fù)到你調(diào)節(jié)PH時(shí)的PH值。培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)用二氧化碳培養(yǎng)箱就是這個(gè)作用。 DMSO影響應(yīng)該不大，我們用的也是SIGAMA的。 |
2樓2011-09-24 17:25:07
3樓2011-09-24 19:27:18
5樓2011-09-26 10:26:07
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