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[交流]
MTT法檢測hegf生長因子活性系列問題求助
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最近實驗一直在做MTT實驗，注意不是毒理性實驗，是檢測藥物（hegf人表皮生長因子）活性實驗，hegf可促進成纖維細胞的生長，通過MTT測定檢測其促細胞生長的能力，即hegf的活性。我的實驗設(shè)計和基本方法如下： 1.使用細胞為：Balb/c3T3小鼠成纖維細胞 2.培養(yǎng)基為DMEM和FBS ，但藥典方法使用的是R1640和CS，這兩個組合我都進行過實驗，結(jié)果都是不理想。 3.實驗設(shè)計如下： 類別 種板細胞數(shù) 設(shè)置復孔數(shù)/個 濃度梯度（4倍稀釋）/個 hegf標準品 5000個/孔 3 8 hegf樣品 5000個/孔 3 8 陽性對照 5000個/孔 3 無 陰性對照 5000個/孔 3 無 空白對照 無 6 無 注：維持培養(yǎng)基為加入0.4%的血清，完全培養(yǎng)基是加入10%的血清。 5.培養(yǎng)時間和條件都與藥典方法一致。 經(jīng)過一段時間的摸索，現(xiàn)有如下問題，有經(jīng)驗的朋友一定要多指教，謝謝！ 1.陰性對照組的結(jié)果比標準品組和樣品組的結(jié)果要好，但比陽性對照差。（理想的結(jié)果是陽性對照組是最好，標準品組和樣品組次之，陰性對照組是最差。） 2.實驗數(shù)據(jù)的平行性非常差，在加入MTT孵育4h后，在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)復孔的平行性非常差（MTT只對活細胞有作用，與琥珀酸脫氫酶反應后產(chǎn)生紫色結(jié)晶，所以在顯微鏡下觀察，可以明顯看到結(jié)晶的量多少），個別孔的紫色結(jié)晶量非常少，有些孔又很多。這個問題是不是跟細胞的狀態(tài)有關(guān)，在培養(yǎng)過程中，細胞生長和死亡率不一致，導致平行性非常差。 3.酶標儀波長和震蕩時間的問題：藥典使用的波長是以630nm為參考波長，570nm為檢測波長，由于實驗室沒有條件，我們使用的是490nm的波長檢測，在網(wǎng)上看了相關(guān)資料，有些朋友說490nm的波長也可以使用，靈敏度也不錯，不知道是否可行。 現(xiàn)在我們實驗在酶標儀的震蕩時間設(shè)置為30秒 強震蕩。震蕩的目的是為了使紫色結(jié)晶溶解更充分，能不能設(shè)置震蕩時間越長越好呢？時間過長也會影響實驗數(shù)據(jù)么？目前我們設(shè)定的時間和震蕩強度是不是合理的呢，有經(jīng)驗的朋友給些建議吧。 4.培養(yǎng)基PH值的問題：我們使用R1640干粉培養(yǎng)基配制，配制過程按照說明書進行，調(diào)節(jié)PH值7.0，過濾后PH值為7.48或者7.47， 而細胞培養(yǎng)基的PH值為7.2-7.4，略高的PH值對細胞影響大不大？如果重新調(diào)整PH值后，再進行過濾，配制的R1640還能繼續(xù)使用嗎？DMEM培養(yǎng)基我們是直接購買GIBCO的，不需要配制，但在使用一段時間后發(fā)現(xiàn)其PH值升到8以上，這樣的培養(yǎng)基還能繼續(xù)使用么？ 有些朋友說，可以通入無菌的二氧化碳氣體調(diào)節(jié)PH值，但是我們實驗室沒有這樣的條件，是否可以使用1N的HCL調(diào)節(jié)，然后過濾？還有些朋友說可以擰松蓋子放到通有二氧化碳的培養(yǎng)箱內(nèi)放置一段時間，PH就會下降，這樣的操作可行嗎？ 有什么方法可以很好的保存培養(yǎng)基，維持PH值恒定？ 注：我們的培養(yǎng)基都是放在4度冰箱保存。 5.DMSO的問題：看到資料說進行細胞凍存，一段要使用特定的DMSO,如Sigma D2650) ，我們使用的是sigma的DMSO，但是型號好像不是這個，不知道行不行？MTT實驗使用的DMSO也是sigma的，有些人可能是使用國產(chǎn)的吧。 暫時想到這么多問題，后續(xù)有問題再補充吧。 |
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9樓2011-09-29 18:01:25
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖
luolh2004(金幣+10): 謝謝回帖交流 2011-09-24 19:24:12
lstt09nk(金幣+5): 鼓勵下 2011-09-25 12:46:56
silicare(BioEPI+1): 2011-09-27 17:04:39
小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖
luolh2004(金幣+10): 謝謝回帖交流 2011-09-24 19:24:12
lstt09nk(金幣+5): 鼓勵下 2011-09-25 12:46:56
silicare(BioEPI+1): 2011-09-27 17:04:39
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樓主做MTT只做一次還是每天都做呢？ 比如我們的實驗都是這樣的：同一個劑量組，做8個孔，每天拿一個孔來進行測量，連續(xù)做8天。同時做3個復孔。做一組生長曲線，通過生長曲線來比較效果。 我們是振蕩10S 1640是加過碳酸氫鈉的么？如果是加過的，放一段時間PH升高是因為碳酸氫鈉變?yōu)樘妓徕c了，你放入高二氧化碳的培養(yǎng)箱里，二氧化碳可以溶入培養(yǎng)基，又生成碳酸氫鈉，可以回復到你調(diào)節(jié)PH時的PH值。培養(yǎng)細胞時用二氧化碳培養(yǎng)箱就是這個作用。 DMSO影響應該不大，我們用的也是SIGAMA的。 |
2樓2011-09-24 17:25:07
3樓2011-09-24 19:27:18
5樓2011-09-26 10:26:07
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