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生興生物銀蟲 (小有名氣)
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【專題】細胞活力檢測------MTT比色法 已有2人參與
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Q：細胞活力檢測中，MTT比色法的原理？ A：活細胞中的脫氫酶能將MTT還原成不溶于水的藍紫色產(chǎn)物（甲臜，F(xiàn)ormazan)，并沉淀在細胞中，而死細胞沒有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細胞中的藍紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的Formazan量成正比，最后用酶標儀測定OD值。 Q：MTT比色法細胞活力檢測實驗中有哪些注意事項？ A：（1）選擇適當?shù)募毎臃N濃度。一般情況下，96孔培養(yǎng)板的內(nèi)貼壁細胞長滿時約有l(wèi)o6個細胞。但由于不同細胞貼壁后面積差異很大，因此，在進行MTT比色法細胞活力檢測實驗前，掌握每一種細胞的貼壁率、倍增時間以及不同接種細胞數(shù)條件下的生長曲線，確定實驗中每孔的接種細胞數(shù)和培養(yǎng)時間，以保證培養(yǎng)終止致細胞過滿。這樣，才能保證形成酌量的MTT結(jié)晶，與細胞數(shù)量呈線性關(guān)系。 （2）避免血清干擾。用含15%胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞時，高濃度的血清物質(zhì)會影響實驗孔的光吸收值。由于實驗本底增加，會使實驗敏感。因此，一般選擇濃度小于10%胎牛血清的培養(yǎng)液進行。在呈色后，盡量吸凈培養(yǎng)孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。 3）設(shè)空白對照。與實驗孔平行設(shè)不加細胞只加培養(yǎng)液的空白孔。其它實驗步驟保持一致。最后比色時，以空白孔調(diào)零。 Q：MTT比色法細胞活力檢測染色后，96孔板中的上清棄去后是否要用PBS洗一下再加二甲亞砜？ A：不必洗，MTT與Fomazan的顏色不同，吸光譜也不同，實際上測的是OD570的吸收光，實際MTT的吸光度在此波長很小。Fomazan對細胞是有害的，部分細胞死掉后，F(xiàn)ormazan結(jié)晶在其周圍，如果清洗就丟失了。 Q：MTT比色法細胞活力檢測中對照設(shè)置很重要嗎？ A： MTT比色法細胞活力檢測中最重要的就是背景對照，就是不加細胞的對照。這包括兩方面內(nèi)容，一是指與實驗孔相同，對照孔中也加入相同體積的培養(yǎng)基，各做3-4個復孔，取平均值，主要目的是為了減少培養(yǎng)基中含有的酚紅對比色的影響；二是要在對照孔內(nèi)加入與實驗孔相同成分和濃度的藥物（特別是藥物pH值為酸性或堿性時），同樣也是為了減少比色時的誤差。 Q：如何解決酶標儀測出的數(shù)據(jù)總是不穩(wěn)定、重復性差的問題？A：加樣CV控制在5%以內(nèi)； 防止細胞丟失； 充分震蕩，溶解甲臢； OD值盡量控制在0.3-0.6之間； 做空白對照。 Q：如何讓二甲亞砜溶解充分？ A：如果細胞是貼壁生長的，吸棄上清液后，每孔加入150 μl 二甲亞砜，振蕩10 min；如果是懸浮生長的細胞，需離心（1000 rpm，5 min），然后棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液后再加二甲亞砜。 Q：MTT法細胞活力檢測細胞活力時，如何確定加藥物的時間？A：一般文獻報道的方法，是貼壁細胞在細胞貼壁后加藥物（一般為上板后24h），而懸浮細胞是上板同時加。 但是，在操作中具體要根據(jù)實驗本身要檢測的指標來確定時間。如果是做有關(guān)細胞增殖的藥物，加藥的時機影響不大，主要是藥物的作用時間起決定性因素；如果要檢測的是其他一些指標（比如藥物對細胞黏附功能的影響），就要在細胞貼壁以前加藥了 Q：MTT法細胞活力檢測貼壁細胞活力時，如何確定細胞接種到96孔板的時間？ A：貼壁細胞一般在實驗前1-2日接入96孔板。太晚，細胞在傳代后有一個16小時左右的停滯期，此時代謝變慢，增殖緩慢，此時的MTT數(shù)值太低；太早，實驗期間，細胞生長過頭，此時有死亡和凋亡的細胞，實驗時本底又過高，應(yīng)該尋求的效果是實驗時落在細胞對數(shù)早中期最好。 |
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