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鬼筆壞壞新蟲 (初入文壇)
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[交流]
【求助/交流】怎么做都提不出DNA，請高手幫一下忙嘍�。。。� 已有23人參與
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怎么做都提不出DNA，請高手幫一下忙嘍�。。。� 我是從青霉菌里提的，開始用的SDS法，液氮研磨+500ul抽提緩沖液65℃水浴1h后，12000離心10min，加兩次氯仿：異戊醇（24：1）后離心10Min,12000收集上清，加等體積異丙醇-20放置30min以上，13500離心，用75%乙醇洗無菌風(fēng)吹干后加無菌水溶的，結(jié)果跑電泳只有RNA。然后做了好多次都這樣。又換的氯化芐法，（液氮研磨0.1g+500ul緩液+125uLDE 10%SDS+300uL氯化芐，50℃，1h）做這個我連醋酸鈉PH都調(diào)到5.2了，結(jié)果還是沒有。就崩潰了,麻煩高手給指導(dǎo)一下！��！ [ Last edited by 1949stone on 2011-4-21 at 12:54 ] |
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冼亮淀粉酶
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小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖交流
1949stone(金幣+4): 考慮epi 2011-04-21 12:58:23
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1949stone(金幣+4): 考慮epi 2011-04-21 12:58:23
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樓主上圖，提取得到的樣品的電泳圖，看看有沒有什么RNA和DNA，別忘了點上兩個ladder，λ 線性DNA用于指示青霉DNA，1kb DNA 用于指示RNA。當(dāng)然，如果有經(jīng)驗了，就點上這兩個中的一個就可以了。附上我的一張電泳圖，第一個泳道是λ 線性DNA大概四十多KB，泳道2、3、4共三個是真菌基因組DNA，可以看得到在λ 線性DNA相似大小的地方有一條亮帶，那就是真菌基因組DNA；在泳道前面部分有一大堆長長的是RNA。 [ Last edited by 冼亮淀粉酶 on 2011-4-15 at 23:58 ] |
20樓2011-04-15 23:37:54
冼亮淀粉酶
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小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖交流
1949stone(EPI+1): 哈哈 epi來也 2011-04-21 12:58:46
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1949stone(EPI+1): 哈哈 epi來也 2011-04-21 12:58:46
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如果有了RNA，當(dāng)然就是表示已經(jīng)破胞成功了，因為細(xì)胞內(nèi)才有RNA。 我用的抽提液配方為 成分 濃度 NaCl 200mmol/L EDTA-Na2 4mmol/L SDS 2% Tris-HCl(pH=8.0) 100mmol/L 與你的不一樣，我用的方法和你的也不一樣 2.4.14.1真菌總DNA的提取 （1）接種菌株至液體培養(yǎng)基中，28℃，180rpm振蕩培養(yǎng)3天； （2）用滅菌紗布過濾，并壓干菌體； （3）將菌絲體倒入研缽（滅菌并預(yù)冷），迅速倒入液氮，研磨至粉末狀； （4）將粉末移至1.5mL的EP管中，加入600µL真菌提取液； （5）加等體積苯酚/氯仿，輕輕倒轉(zhuǎn)混合，10000rpm離心10min； （6）取400µL上清液移入新的1.5mlLEP管，重復(fù)步驟（5）之后以等體積氯仿抽提一次； （7）取上清液，加入兩倍體積無水乙醇，-20℃放置30min； （8）10000rpm 離心10min，75%乙醇洗沉淀2次，真空干燥； （9）以20µL 1×TE 溶解沉淀； （10）電泳檢測總DNA的濃度。 |
22樓2011-04-16 14:36:31
冼亮淀粉酶
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小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖交流
西瓜(金幣+2, EPI+1): 熱心、專業(yè) 2011-04-20 23:11:06
小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖交流
西瓜(金幣+2, EPI+1): 熱心、專業(yè) 2011-04-20 23:11:06
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“我是從青霉菌里提的，開始用的SDS法，液氮研磨+500ul抽提緩沖液65℃水浴1h后，12000離心10min，加兩次氯仿：異戊醇（24：1）后離心10Min,12000收集上清，加等體積異丙醇-20放置30min以上，13500離心，用75%乙醇洗無菌風(fēng)吹干后加無菌水溶的，結(jié)果跑電泳只有RNA�！� 青霉和曲霉我都提取過，加起來超過50個菌株，都能提取成功且作為模板PCR出來產(chǎn)物。我對這些步驟有點想法： 1、“65℃水浴1h”這個步驟我不知道起什么作用，是不是想熱脹冷縮反復(fù)凍融加速真菌破胞？我在建宏基因組文庫提取DNA的時候也沒有用過那么高的溫度。如果是想這樣，就不必了，因為液氮研磨結(jié)束之后再高溫也沒用。當(dāng)然我也只是猜測這一步是想達(dá)到這個效果，其實我是真的不知道設(shè)計這個步驟的人想要達(dá)到怎樣的效果。 2、異丙醇只加了總體積的1/50，其作用是使得上下相分層更加清晰，這個添加量對蛋白質(zhì)沒有任何變性作用。我用異丙醇提取淀粉酶的時候加了十倍于酶液體積才能把蛋白質(zhì)全都沉淀下來，而且沉淀再溶解的時候蛋白質(zhì)損失很少的，所以別寄望于異丙醇能使得蛋白質(zhì)變性。氯仿能使蛋白質(zhì)變性，雖然效果比異丙醇好很多，但是也不能全部變性。真正能使蛋白質(zhì)變性的是酚類，所以我才用1/4的苯酚（1/4的氯仿，1/2的含DNA的混合液）。我懶得加異丙醇。一般抽提可以兩次，之后再加1/2的氯仿把苯酚萃取干凈，這樣可以把蛋白質(zhì)去除得較好。 3、異丙醇可以用來沉淀DNA，而且沉淀出來也是絮狀的。我在建宏基因組文庫的時候DNA是用乙醇來沉淀的，把DNA過凝膠層析柱，洗脫液滴到乙醇里，有了DNA就馬上沉淀，這些含有很少腐殖酸的DNA可以用槍頭挑出來重新溶解跑膠。異丙醇當(dāng)然也是可以沉淀RNA的，所以跑電泳的時候也有RNA。 4、多糖也可能會被異丙醇沉淀下來，假如用75%乙醇洗過，風(fēng)干的DNA像是白色結(jié)塊，不能完全溶解，不要緊，只要將其完全打散，再在50度水浴鍋充分溶解，之后放到4度去冷凍，再高速離心去除沉淀取上清液就行。如果還想除去更多，可以在-20度過夜，結(jié)冰之后低溫溶解，再高速離心取上清液就行。DNA可溶，所以不會損失太多的。這個沉淀不一定是白色，如果真菌產(chǎn)了孢子有了顏色，提取DNA的時候把孢子也用了，那么色素會有殘留，這時候白色沉淀就是有了色素的顏色，但是不影響PCR。 |
23樓2011-04-16 15:08:43
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28樓2011-04-20 22:39:16
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30樓2011-04-20 23:15:15
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