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[交流] 【求助/交流】急！半定量PCR結(jié)果太不穩(wěn)定

我做半定量PCR相看基因表達(dá)量的變化趨勢，上調(diào)、下調(diào)或者不變。做半定量PCR做了很久，每一個基因都重復(fù)做了好幾次，可是結(jié)果相當(dāng)?shù)牟环€(wěn)定，一個基因有時候上調(diào)，有時候下調(diào)。我都不知道該怎么分析結(jié)果。煩哪�。�！有沒有做過半定量的朋友提供一點經(jīng)驗，幫幫忙��！
先謝過了！由于之前散盡了金幣，現(xiàn)在金幣較少，我會逐漸加上去的！請大家?guī)蛶兔Γ?br />
[ Last edited by friend.11 on 2011-3-31 at 19:57 ]

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1樓 2011-03-30 20:52:40

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咸魚

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★ ★ ★
lstt09nk(金幣+3): 感謝分享經(jīng)驗~ 2011-03-30 22:50:13
friend.11(金幣+2): 你說的是定量！不過還是謝謝你！ 2011-03-31 19:46:44

我做過Real-time，我的基因每次做都挺穩(wěn)定，你每次加樣，操作都沒問題嗎？不過我們一個師兄芯片數(shù)據(jù)，我看有好多基因，三組數(shù)據(jù)之間結(jié)果也不穩(wěn)定，有的上調(diào)，有的下調(diào)。我自己覺得這樣的話，如果上調(diào)下調(diào)變化不大，是不是可以說基本上是對你所說的那個因素是不敏感的。它的不穩(wěn)定只是因為環(huán)境或其他因素影響。至少跟那個因素之間沒有直接關(guān)系，或者有也不是在基因水平，而是蛋白水平了吧。

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2樓2011-03-30 21:07:43

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friend.11(金幣+2): 謝謝！ 2011-03-31 19:55:28

做real time，重復(fù)三次，每次pcr做triplicate。主要看增加倍數(shù)和sd，用統(tǒng)計學(xué)方法分析差異的顯著性。

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3樓2011-03-30 21:17:49

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hwlightning

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friend.11(金幣+1): 2011-04-03 16:48:03

做定量PCR

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4樓2011-04-03 13:50:49

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rb

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friend.11(金幣+1): 2011-04-03 16:48:24

現(xiàn)在半定量已經(jīng)很少采用了。如果做半定量，那么起始濃度的標(biāo)化非常重要。使用的PCR儀要固定，mix要同一批。還是建議用實時定量PCR不會比半定量貴多少，結(jié)果還更可靠。

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5樓2011-04-03 16:04:52

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dreaming0816

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friend.11(金幣+1): 2011-04-04 14:57:19

半定量要把目的片段與內(nèi)參放在一個管內(nèi)做PCR和電泳的。

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6樓2011-04-03 16:58:59

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friend.11(金幣+2): 2011-04-04 14:56:58

半定量的工作量其實比定量的工作量還要大，建議做定量，所有的東西都不用換，就把premix換成SB Green1就可以了。

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7樓2011-04-03 17:00:46

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引用回帖:

Originally posted by dreaming0816 at 2011-04-03 17:00:46:
半定量的工作量其實比定量的工作量還要大，建議做定量，所有的東西都不用換，就把premix換成SB Green1就可以了。

還要重新設(shè)引物吧！

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8樓2011-04-04 14:56:49

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Originally posted by dreaming0816 at 2011-04-03 16:58:59:
半定量要把目的片段與內(nèi)參放在一個管內(nèi)做PCR和電泳的。

放在一管里面引物會競爭模板吧！

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9樓2011-04-04 14:57:55

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jhu132llh

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friend.11(金幣+2): 謝謝！ 2011-04-06 10:51:02
看天(金幣+2): 鼓勵 2011-04-06 12:53:51

引用回帖:

Originally posted by friend.11 at 2011-03-30 20:52:40:
我做半定量PCR相看基因表達(dá)量的變化趨勢，上調(diào)、下調(diào)或者不變。做半定量PCR做了很久，每一個基因都重復(fù)做了好幾次，可是結(jié)果相當(dāng)?shù)牟环€(wěn)定，一個基因有時候上調(diào)，有時候下調(diào)。我都不知道該怎么分析結(jié)果。煩哪�。�！ ...

做半定量是很麻煩的事情
首先你得保證每個PCR反應(yīng)之間的操作手法還有膠什么的沒有什么太大的差異的，說白了，就是你的手法首先要穩(wěn)定；
其次，照膠的影響也是挺大的，因為軟件存在一個識別問題；
再次，你做半定量分析的時候，軟件的使用也會挺有影響的，同樣一塊區(qū)域，選區(qū)大點和小點可能就會有差異，建議手動校正選區(qū)。

實在不行，就該定量吧，現(xiàn)在定量試劑盒都很成熟了，并且，定量的數(shù)據(jù)好發(fā)文章

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10樓2011-04-05 17:01:22

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friend.11(金幣+1): 能說說你后面“沒變化”是改變了什么沒？ 2011-04-06 10:47:24

引用回帖:

我跟你你的情況一樣，本來做的有變化，重復(fù)一下沒有變化了

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11樓2011-04-05 23:25:55

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小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖

送鮮花一朵

我做定量PCR也是這樣的，本來有變化的，可是重復(fù)的時候，有時候有變化，有時候不變，做了十來次了...這種結(jié)果怎么辦啊？該怎么取舍？請教各位高人了��！

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12樓2012-06-05 15:11:19

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1266612樓: Originally posted by kinda_ at 2012-06-05 15:11:19
我做定量PCR也是這樣的，本來有變化的，可是重復(fù)的時候，有時候有變化，有時候不變，做了十來次了...這種結(jié)果怎么辦��？該怎么取舍？請教各位高人了��！

我的變化倍數(shù)很少，才2-3倍，會不會這種變化本身就不可靠呢？

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13樓2012-06-05 15:12:30

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