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20025405木蟲 (正式寫手)
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[交流]
【求助/交流】大腸桿菌有的是表達(dá)載體的宿主，有些事克隆載體的宿主，他們的區(qū)別在哪? 已有9人參與
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| 大腸桿菌有的是表達(dá)載體的宿主，有些事克隆載體的宿主，他們的區(qū)別在哪？克隆載體的宿主（JM109或NM522）可以用來作為表達(dá)載體的宿主嗎？ |
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jhu132llh
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表達(dá)載體也許可以用來做克隆載體 但是克隆載體一般是不能用來做表達(dá)載體的 原因如下： 例如：克隆載體DH5α有DNA酶缺陷，適合用于克�。ㄙ|(zhì)粒DNA不容易被干掉，可以過量復(fù)制），而表達(dá)載體BL21貌似是有蛋白酶缺陷，適合用于表達(dá)。 酶切、連接之后，不能保證片段一定連上去，所以需要一個(gè)驗(yàn)證的過程，這就需要提質(zhì)粒。所以先把連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α，挑選單菌落，然后驗(yàn)證。 就是說，如果你需要把外源片段插入質(zhì)粒里，那在酶切、連接之后，先把重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5α里面，然后篩選轉(zhuǎn)化子（例如，提質(zhì)粒后酶切驗(yàn)證、PCR驗(yàn)證等等）；篩選到含有正確的重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子后，再搖菌，把重組質(zhì)粒提出來，轉(zhuǎn)化到BL21里面，用于誘導(dǎo)表達(dá)蛋白質(zhì)。 參考鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=3037957&fpage=1 |
4樓2011-04-05 17:49:04
newtime007
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rainwander(金幣+2): 鼓勵(lì)交流~~~ 2011-04-05 19:21:09
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克隆載體：是能夠通過限制性內(nèi)切酶，將目的DNA片段整合進(jìn)去，并且能夠轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)的生物DNA。常見的有質(zhì)粒，病毒，噬菌體等 表達(dá)載體：是用來連接植入基因的DNA鏈. 根據(jù)上述載體的定義可知大腸桿菌中的表達(dá)載體的宿主和克隆載體的宿主市有區(qū)別的，它們的培養(yǎng)、選擇要與相應(yīng)的的功能基因?qū)?yīng)。 |
2樓2011-04-05 16:11:03
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我沒有嘗試過用克隆宿主細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，或者用表達(dá)宿主細(xì)胞進(jìn)行克隆，所以下面的討論僅以我所掌握的理論知識(shí)為基礎(chǔ)。按照我的理解： 1、克隆載體應(yīng)該用克隆載體的宿主進(jìn)行轉(zhuǎn)化。 如進(jìn)行藍(lán)白斑篩選時(shí)，需要lacZ△M15的基因型。 2、表達(dá)載體應(yīng)該用表達(dá)載體的宿主進(jìn)行轉(zhuǎn)化。 如pET載體系統(tǒng)，需要宿主菌基因組中有l(wèi)ac promoter驅(qū)動(dòng)的T7 RNA pol基因，才能轉(zhuǎn)錄外源目的基因基因。 樓主的問題，以前我也有過疑問，可惜知識(shí)淺薄。我覺得要想真正搞懂，需要全面了解宿主基因型，希望樓下的網(wǎng)友不吝賜教�。�！ |
9樓2011-04-07 09:13:04
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10樓2011-04-07 19:21:27
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