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zhaoxinrui0511金蟲 (小有名氣)
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[求助]
克隆基因和載體連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，為什么每次涂板都是空平板沒有菌落？
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小弟快崩潰了，請大家?guī)蛶兔Γ?br />
目的基因經(jīng)PCR擴(kuò)增后（引物上分別加入：Nco I和Xba I酶切位點）和T載體相連，經(jīng)測序驗證序列唔錯，之后從T載體上用Nco I和Xba I雙酶切重新獲得了目的基因（酶切產(chǎn)物的純化采用寶生物的膠回收），同時將可以在大腸桿菌中復(fù)制存在的乳酸菌載體pNZ8148用Nco I和Xba I雙酶切（酶切產(chǎn)物的純化采用寶生物的膠回收），按載體：目的片段（1：4）連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，為什么每次涂板都是空平板沒有菌落？（但我直接轉(zhuǎn)化pNZ8148空載體每次都可以張很多菌落）。 小弟著急畢業(yè)，請各位大哥幫幫忙吧。 |
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beibei9535
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5樓2011-04-24 20:14:26
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【答案】應(yīng)助回帖
zhaoxinrui0511(金幣+3): 2011-05-05 11:56:26
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1) 在進(jìn)行克隆時，Vector DNA和Insert DNA的摩爾比一般為：1 ：2～10。Insert DNA的使用量(ng)=nmol數(shù)×660×Insert DNA的bp數(shù)。 2) 按照本實驗操作進(jìn)行連接后，直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化時的連接液不要超過20 μl。當(dāng)要轉(zhuǎn)化的DNA量較大或準(zhǔn)備進(jìn)行電轉(zhuǎn)化時，需對連接液進(jìn)行乙醇沉淀，純化DNA后再進(jìn)行轉(zhuǎn)化。進(jìn)行乙醇沉淀時使用核酸共沉劑(TaKaRa Code：D605A)可以提高DNA的回收率。 |
6樓2011-04-24 21:15:39
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9樓2011-04-29 16:44:37
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10樓2012-05-06 20:20:38
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