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elbo

金蟲 (小有名氣)

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[求助] 求助 PMD 18T載體克隆轉(zhuǎn)化詳細(xì)不住已有1人參與

目的片段200bp左右，根據(jù)寶生物說(shuō)明書上貌似做不出來(lái)，請(qǐng)問(wèn)前輩高人給予詳細(xì)的實(shí)際操作步驟，不勝感激！

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1樓 2012-07-03 19:23:15

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游俠892

鐵桿木蟲 (著名寫手)

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【答案】應(yīng)助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+5, MolEPI+1, 熱心的蟲子，很詳細(xì)的步驟啊 2012-07-05 13:47:12

連接反應(yīng)
A. 檢查試劑盒內(nèi)的試劑是否完整（pMD 18-T Vector、solution I和control DNA），試劑盒必須存放在-20℃。操作前應(yīng)該瀏覽一下試劑盒提供的說(shuō)明書;
B. 開(kāi)啟載體(pMD 18-T Vector)所在的離心管前請(qǐng)先離心，按照TAKARA公司提供的試劑盒說(shuō)明書配置連接反應(yīng)混合物(以下為一個(gè)反應(yīng)的量)：
pMD 18-T Vector 0.5 µl
solution I 2.5 µl
C. 將PCR管標(biāo)記好，對(duì)應(yīng)每管中加入上述回收的產(chǎn)物2 µl，control DNA用1 µl；
D. 分裝連接反應(yīng)混合液(3µl)；
E. 離心至底部，給PCR管蓋上蓋子（盡量不要使用礦物油）；
F. PCR儀中16℃連接90分鐘或4連接過(guò)夜（冰箱中）。

2) 轉(zhuǎn)化
方法一：熱激轉(zhuǎn)化

A. 將所有需要使用的無(wú)菌耗材準(zhǔn)備好；開(kāi)啟超凈工作臺(tái)；
B. 待用的移液器前端用75%的酒精消毒，放置在工作臺(tái)上風(fēng)干；
C. 將連接液快速離心后，取出2 µl放置于無(wú)菌1.5 ml離心管底部，置于冰盤中；
D. 從-70℃冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞，立即置于冰盤上。（注意：每支約100 µl，可做2個(gè)轉(zhuǎn)化反應(yīng)；取出后不能放回冰箱，因此須計(jì)算使用的感受態(tài)細(xì)胞支數(shù)，管中未用完的則予以丟棄）；
E. 待感受態(tài)細(xì)胞在冰盤中稍微融解后（5分鐘），用無(wú)菌槍頭輕柔的混勻細(xì)胞混合物。緩慢吸取50 µl感受態(tài)細(xì)胞至步驟3中的離心管中，用槍頭輕輕混勻；蓋嚴(yán)蓋子后冰浴20分鐘；
F. 將水浴鍋調(diào)到42（溫度必須準(zhǔn)確，而且不能上下波動(dòng)，建議不要使用本室水浴鍋）。將離心管在水浴鍋中熱激90秒，注意：熱激時(shí)必須保持離心管穩(wěn)定，不能飄動(dòng)更不能搖動(dòng)。立即將離心管放回冰上冰浴2分鐘；
G. 加入950 µl的室溫LB（無(wú)氨芐青霉素）液體培養(yǎng)基至離心管中，于37℃的搖床中150 rpm培養(yǎng)1.5h；
H. 取出100 µl的培養(yǎng)物涂于37℃預(yù)熱的LB固體培養(yǎng)基（含氨芐青霉素）表面；
I. 37℃恒溫箱中過(guò)夜培養(yǎng)（16小時(shí)左右）。

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路漫漫其修遠(yuǎn)兮，吾將上下而求索

7樓2012-07-05 11:02:21

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Marado

金蟲 (正式寫手)

Dreamer

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【答案】應(yīng)助回帖

★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2012-07-04 13:44:44

給一個(gè)我們實(shí)驗(yàn)室常用的連接體系你吧：
pMD 18T：0.5ul
目的DNA:2.5ul
Solution I: 3ul
總計(jì)：6ul的體系

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Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?

2樓2012-07-03 21:07:31

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Marado

金蟲 (正式寫手)

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【答案】應(yīng)助回帖

引用回帖:

2樓: Originally posted by Marado at 2012-07-03 21:07:31
給一個(gè)我們實(shí)驗(yàn)室常用的連接體系你吧：
pMD 18T：0.5ul
目的DNA:2.5ul
Solution I: 3ul
總計(jì)：6ul的體系

實(shí)際DNA：載體的比例要根據(jù)你DNA的濃度來(lái)確定，一般是3:1~10:1的范圍.

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3樓2012-07-03 21:08:47

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第五平原

木蟲 (正式寫手)

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【答案】應(yīng)助回帖

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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2012-07-04 13:44:58

我們實(shí)驗(yàn)室的體系：
pMD 18T：1ul
目的DNA:4ul
Solution I: 5ul
總計(jì)：10ul的體系,16度過(guò)夜連接

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勤勉

4樓2012-07-03 22:03:55

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l68266152

銀蟲 (小有名氣)

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【答案】應(yīng)助回帖

感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1

你給的信息太不詳細(xì)了，不知道是哪一步出得問(wèn)題，感受態(tài)效率過(guò)低？PCR產(chǎn)物沒(méi)加A？都是可能的問(wèn)題。

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相信自己

5樓2012-07-04 08:50:46

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elbo

金蟲 (小有名氣)

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需要做克隆轉(zhuǎn)化的詳細(xì)步驟，實(shí)驗(yàn)室之前的人一直沒(méi)做出來(lái)，想秋一個(gè)詳細(xì)攻略

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6樓2012-07-04 15:36:32

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shicaozhu

銀蟲 (小有名氣)

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【答案】應(yīng)助回帖

感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1

我們用的是寶生物的T載，只要solutionI沒(méi)有問(wèn)題，一般都能連得上，最好做一個(gè)藍(lán)白斑篩選，這樣效率會(huì)高一些。感受態(tài)用寶生物的試劑盒做的，效率很高，也就是冰浴30min,42℃熱擊90s，涂平板后如果是JM109的話9個(gè)小時(shí)就能看到藍(lán)白斑，然后挑白的做個(gè)菌落PCR。我們連接體系一般是質(zhì)粒1微升，片段2微升（pcr產(chǎn)物切膠回收的），水2微升，solutionI 5微升。16℃30min就好，不用過(guò)夜，所以說(shuō)拿到克隆從pcr開(kāi)始也就是兩天的事。個(gè)人經(jīng)驗(yàn)，僅供參考，樓主好運(yùn)！

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8樓2012-07-05 16:40:58

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elbo

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引用回帖:

7樓: Originally posted by 游俠892 at 2012-07-05 11:02:21
連接反應(yīng)
A. 檢查試劑盒內(nèi)的試劑是否完整（pMD 18-T Vector、solution I和control DNA），試劑盒必須存放在-20℃。操作前應(yīng)該瀏覽一下試劑盒提供的說(shuō)明書;
B. 開(kāi)啟載體(pMD 18-T Vector)所在的離心管前請(qǐng)先離心， ...

非常感謝

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9樓2012-07-05 17:11:08

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楊仔兒

木蟲 (著名寫手)

應(yīng)助: 6 (幼兒園)
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在線: 290.2小時(shí)
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4樓: Originally posted by 第五平原 at 2012-07-03 22:03:55
我們實(shí)驗(yàn)室的體系：
pMD 18T：1ul
目的DNA:4ul
Solution I: 5ul
總計(jì)：10ul的體系,16度過(guò)夜連接

這個(gè)體系的量和目的基因的濃度沒(méi)關(guān)系嗎？

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10樓2015-06-23 16:21:26

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