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elbo金蟲 (小有名氣)
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求助 PMD 18T載體克隆轉化詳細不住 已有1人參與
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| 目的片段200bp左右，根據(jù)寶生物說明書上貌似做不出來，請問前輩高人給予詳細的實際操作步驟，不勝感激！ |
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Marado
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感謝參與，應助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+5, MolEPI+1, 熱心的蟲子，很詳細的步驟啊 2012-07-05 13:47:12
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連接反應 A. 檢查試劑盒內的試劑是否完整（pMD 18-T Vector、solution I和control DNA），試劑盒必須存放在-20℃。操作前應該瀏覽一下試劑盒提供的說明書; B. 開啟載體(pMD 18-T Vector)所在的離心管前請先離心，按照TAKARA公司提供的試劑盒說明書配置連接反應混合物(以下為一個反應的量)： pMD 18-T Vector 0.5 µl solution I 2.5 µl C. 將PCR管標記好，對應每管中加入上述回收的產(chǎn)物2 µl，control DNA用1 µl； D. 分裝連接反應混合液(3µl)； E. 離心至底部，給PCR管蓋上蓋子（盡量不要使用礦物油）； F. PCR儀中16℃連接90分鐘或4連接過夜（冰箱中）。 2) 轉化 方法一：熱激轉化 A. 將所有需要使用的無菌耗材準備好；開啟超凈工作臺； B. 待用的移液器前端用75%的酒精消毒，放置在工作臺上風干； C. 將連接液快速離心后，取出2 µl放置于無菌1.5 ml離心管底部，置于冰盤中； D. 從-70℃冰箱中取出感受態(tài)細胞，立即置于冰盤上。（注意：每支約100 µl，可做2個轉化反應；取出后不能放回冰箱，因此須計算使用的感受態(tài)細胞支數(shù)，管中未用完的則予以丟棄）； E. 待感受態(tài)細胞在冰盤中稍微融解后（5分鐘），用無菌槍頭輕柔的混勻細胞混合物。緩慢吸取50 µl感受態(tài)細胞至步驟3中的離心管中，用槍頭輕輕混勻；蓋嚴蓋子后冰浴20分鐘； F. 將水浴鍋調到42（溫度必須準確，而且不能上下波動，建議不要使用本室水浴鍋）。將離心管在水浴鍋中熱激90秒，注意：熱激時必須保持離心管穩(wěn)定，不能飄動更不能搖動。立即將離心管放回冰上冰浴2分鐘； G. 加入950 µl的室溫LB（無氨芐青霉素）液體培養(yǎng)基至離心管中，于37℃的搖床中150 rpm培養(yǎng)1.5h； H. 取出100 µl的培養(yǎng)物涂于37℃預熱的LB固體培養(yǎng)基（含氨芐青霉素）表面； I. 37℃恒溫箱中過夜培養(yǎng)（16小時左右）。 |
7樓2012-07-05 11:02:21
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8樓2012-07-05 16:40:58
elbo
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