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elbo金蟲 (小有名氣)
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求助 PMD 18T載體克隆轉(zhuǎn)化詳細(xì)不住 已有1人參與
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| 目的片段200bp左右，根據(jù)寶生物說明書上貌似做不出來，請(qǐng)問前輩高人給予詳細(xì)的實(shí)際操作步驟，不勝感激！ |
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游俠892
鐵桿木蟲 (著名寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+5, MolEPI+1, 熱心的蟲子，很詳細(xì)的步驟啊 2012-07-05 13:47:12
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小丹木木: 金幣+5, MolEPI+1, 熱心的蟲子，很詳細(xì)的步驟啊 2012-07-05 13:47:12
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連接反應(yīng) A. 檢查試劑盒內(nèi)的試劑是否完整（pMD 18-T Vector、solution I和control DNA），試劑盒必須存放在-20℃。操作前應(yīng)該瀏覽一下試劑盒提供的說明書; B. 開啟載體(pMD 18-T Vector)所在的離心管前請(qǐng)先離心，按照TAKARA公司提供的試劑盒說明書配置連接反應(yīng)混合物(以下為一個(gè)反應(yīng)的量)： pMD 18-T Vector 0.5 µl solution I 2.5 µl C. 將PCR管標(biāo)記好，對(duì)應(yīng)每管中加入上述回收的產(chǎn)物2 µl，control DNA用1 µl； D. 分裝連接反應(yīng)混合液(3µl)； E. 離心至底部，給PCR管蓋上蓋子（盡量不要使用礦物油）； F. PCR儀中16℃連接90分鐘或4連接過夜（冰箱中）。 2) 轉(zhuǎn)化 方法一：熱激轉(zhuǎn)化 A. 將所有需要使用的無菌耗材準(zhǔn)備好；開啟超凈工作臺(tái)； B. 待用的移液器前端用75%的酒精消毒，放置在工作臺(tái)上風(fēng)干； C. 將連接液快速離心后，取出2 µl放置于無菌1.5 ml離心管底部，置于冰盤中； D. 從-70℃冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞，立即置于冰盤上。（注意：每支約100 µl，可做2個(gè)轉(zhuǎn)化反應(yīng)；取出后不能放回冰箱，因此須計(jì)算使用的感受態(tài)細(xì)胞支數(shù)，管中未用完的則予以丟棄）； E. 待感受態(tài)細(xì)胞在冰盤中稍微融解后（5分鐘），用無菌槍頭輕柔的混勻細(xì)胞混合物。緩慢吸取50 µl感受態(tài)細(xì)胞至步驟3中的離心管中，用槍頭輕輕混勻；蓋嚴(yán)蓋子后冰浴20分鐘； F. 將水浴鍋調(diào)到42（溫度必須準(zhǔn)確，而且不能上下波動(dòng)，建議不要使用本室水浴鍋）。將離心管在水浴鍋中熱激90秒，注意：熱激時(shí)必須保持離心管穩(wěn)定，不能飄動(dòng)更不能搖動(dòng)。立即將離心管放回冰上冰浴2分鐘； G. 加入950 µl的室溫LB（無氨芐青霉素）液體培養(yǎng)基至離心管中，于37℃的搖床中150 rpm培養(yǎng)1.5h； H. 取出100 µl的培養(yǎng)物涂于37℃預(yù)熱的LB固體培養(yǎng)基（含氨芐青霉素）表面； I. 37℃恒溫箱中過夜培養(yǎng)（16小時(shí)左右）。 |
7樓2012-07-05 11:02:21
Marado
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2樓2012-07-03 21:07:31
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實(shí)際DNA：載體的比例要根據(jù)你DNA的濃度來確定，一般是3:1~10:1的范圍. 3樓2012-07-03 21:08:47
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4樓2012-07-03 22:03:55
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