xuqingchun33

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[交流] 【求助】pcr引物退火溫度

各位大俠，小弟最近在做PCR,擴(kuò)出的目的條帶及其微弱，但雜帶較亮。引物為以下
上游ATCCACGAGTACCATCATCTATGACTCCTTTAACTTTAG
下游GGCCTCGAGCCGTTAATTTTGTTTGATTTCAGCAT
請求幫助分析原因，并且求具體的退火溫度，謝謝

[ Last edited by xuqingchun33 on 2011-4-7 at 21:47 ]

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1樓 2011-04-07 21:41:56

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forrestgump

新蟲 (著名寫手)

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只能換引物了，不過也得看你的目的了
要是做表達(dá)盡快換，要是克隆弱點無所謂了。

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2樓2011-04-07 23:38:41

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西瓜

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樓主這引物還真是長啊……不是普通的PCR吧？說詳細(xì)點吧。

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3樓2011-04-07 23:52:42

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yabxxh

木蟲 (正式寫手)

請問你的PCR條件怎么樣，前端TM66后端64，如果加了酶切位點，建議降低5度，5個循環(huán)，65度30個循環(huán)，沒加酶切位點的話，直接65度30個循環(huán)，好運(yùn)

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4樓2011-04-08 09:28:42

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jhu132llh

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可以嘗試的方法：
1.適當(dāng)添加一些PCR輔助物，如DMSO、BSA等等，具體的可以參考《分子克隆實驗指南》
2.在現(xiàn)有的退火溫度基礎(chǔ)上逐步提高退火一下溫度，看看產(chǎn)物情況；
3.差異溫度
前5-10循環(huán)可以適當(dāng)提高退火溫度到一個比較高的溫度，比如你的Tm值，然后再接下來的退火溫度恢復(fù)到正常的溫度；
4.再不行，重新設(shè)計一對引物吧，設(shè)計引物后可以去做一下全基因組的引物Blast，看看引物的特異性如何

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5樓2011-04-08 09:49:36

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xuqingchun33

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Originally posted by 西瓜 at 2011-04-07 23:52:42:
樓主這引物還真是長啊……不是普通的PCR吧？說詳細(xì)點吧。

是重疊延伸PCR，上游是重疊引物

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6樓2011-04-08 10:26:09

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西瓜

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xuqingchun33(金幣+1): 2011-04-10 09:55:21

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Originally posted by xuqingchun33 at 2011-04-08 10:26:09:
是重疊延伸PCR，上游是重疊引物

重疊PCR產(chǎn)物微弱是很正常的，而且在引物優(yōu)化上也沒有太大的余地。我們一般會再做一次PCR,以第一次引物的產(chǎn)物為模板，第二次PCR的引物往里退10多bp（一般10bp以上，長點沒關(guān)系），這樣第二次PCR就能得到特異的產(chǎn)物了。這個貌似叫做巢式PCR吧。

當(dāng)然，這樣的話，設(shè)計第一對引物時就要往外延一些了。第一次PCR產(chǎn)物，取10ul跑膠，看到有目的條帶就行，有雜帶也沒關(guān)系。然后取5ul作為模板進(jìn)行第二次PCR。

重疊PCR其他問題也可以問我。

[ Last edited by 西瓜 on 2011-4-8 at 11:28 ]

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7樓2011-04-08 10:42:40

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Originally posted by xuqingchun33 at 2011-04-07 21:41:56:
各位大俠，小弟最近在做PCR,擴(kuò)出的目的條帶及其微弱，但雜帶較亮。引物為以下
上游ATCCACGAGTACCATCATCTATGACTCCTTTAACTTTAG
下游GGCCTCGAGCCGTTAATTTTGTTTGATTTCAGCAT
請求幫助分析原因，并且求具體的退火溫度 ...

如果是做重疊PCR，那么你的這個是中間的重疊引物嘛，貌似沒有設(shè)計好哦，這對引物該是完全互補(bǔ)這樣好做寫的。

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8樓2011-04-08 13:33:55

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Originally posted by 西瓜 at 2011-04-08 10:42:40:
重疊PCR產(chǎn)物微弱是很正常的，而且在引物優(yōu)化上也沒有太大的余地。我們一般會再做一次PCR,以第一次引物的產(chǎn)物為模板，第二次PCR的引物往里退10多bp（一般10bp以上，長點沒關(guān)系），這樣第二次PCR就能得到特異的 ...

重疊和巢式是不一樣的哦~~~

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9樓2011-04-08 13:34:40

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西瓜

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Originally posted by 睡著數(shù)綿羊 at 2011-04-08 13:34:40:
重疊和巢式是不一樣的哦~~~

重疊+巢式

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10樓2011-04-08 14:58:17

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