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[交流]
PCR退火溫度 已有2人參與
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各位蟲友大家好！ 我拿到的引物退火溫度一個是69度，一個62度，PCR程序退火溫度設(shè)多少合適呀？我做的梯度是從52到65的，低溫時在2000和1500左右有微弱的條帶（目的條帶900左右），中間溫度擴出來的在250到100之間有明亮的引物二聚體，高溫沒有任何條帶。 我想再重新p一次，請問大家，從這種結(jié)果看，我的退火溫度取什么范圍的梯度合適呀？還是要重新設(shè)計引物？ O(∩_∩)O謝謝~~ |
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wangqk198738
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7樓2009-08-14 16:26:43
smallcat227
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8樓2009-08-14 17:58:45
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9樓2009-08-14 18:27:26
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樓主，可以的話，把你的反應(yīng)條件也說下。。。 我做PCR多，有些經(jīng)驗，一般兩次就能把東西擴出來。。 你的退火溫度我建議選55到60之間。 按照你說的情況，我認(rèn)為的你的延伸時間有點過高了。如果你的模板是質(zhì)粒，應(yīng)該很輕松就可以擴了。。如果你的模板是真核基因組的話，可以加一些DMSO。 我建議你的反應(yīng)條件可以這樣: 95度，3分 95度20秒，60度30秒，72度1分，（循環(huán)數(shù)你要看你的模板濃度自己定，一般真核基因組用30到35個循環(huán)） 72度3分。 切記，如果是真核基因組的話，加一些DMSO。 如果還不行，可以嘗試TOUCH DOWN PCR。。。即退火溫度從65度到55度每個循環(huán)降一度，再55度退火保持20多個循環(huán)。。 祝順利 |
10樓2009-08-14 19:47:48
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