嘉笛

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[交流] 【求助/交流】PCR退火溫度

請(qǐng)大家?guī)兔聪旅娴囊�，退火溫度�?yīng)該設(shè)為多少？或整個(gè)PCR程序應(yīng)該怎么設(shè)定？目的基因片段全長(zhǎng)705bp，請(qǐng)大家告訴具體數(shù)值或操作步驟，不要寫(xiě)一些公式或軟件，謝謝啦！
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1樓 2010-12-21 16:00:24

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feiye2214

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rainwander(金幣+1):呵呵，鼓勵(lì)積極參與~~~ 2010-12-21 19:11:21
silicare(金幣+2):教育意義更精彩 2010-12-22 08:43:10

引用回帖:

Originally posted by 嘉笛 at 2010-12-21 16:00:24:
請(qǐng)大家?guī)兔聪旅娴囊铮嘶饻囟葢?yīng)該設(shè)為多少？或整個(gè)PCR程序應(yīng)該怎么設(shè)定？目的基因片段全長(zhǎng)705bp，請(qǐng)大家告訴具體數(shù)值或操作步驟，不要寫(xiě)一些公式或軟件，謝謝啦！
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伸手黨

公司給你合成引物的時(shí)候，不是附了合成單了嗎，上面有
一般程序：94 5min 94 30s Tm 30s 72 1min 33cycles 72 10min end
其實(shí)Tm可以做個(gè)梯度試試
多看看文獻(xiàn)吧，不要純伸手啦

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2樓2010-12-21 16:12:04

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yabxxh

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rainwander(金幣+1):鼓勵(lì)積極參與~~~ 2010-12-21 19:11:26
1949stone(金幣+2):很熱心繼續(xù)鼓勵(lì) 2010-12-21 22:45:14

你不想知道為什么要選這些數(shù)值的話(huà)，我可以告訴你：
兩條引物的Tm分別為：Sence：61.66，antisence：66.66
反應(yīng)程序：
94 5min
以下5個(gè)循環(huán)
94 30s
56 30s
72 45s
循環(huán)結(jié)束
以下25個(gè)循環(huán)
94 30s
63 30s
72 45s
循環(huán)結(jié)束

72 10min
4 hold

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3樓2010-12-21 16:22:15

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天使托

專(zhuān)家顧問(wèn) (職業(yè)作家)

果然是伸手黨!自己動(dòng)手，豐衣足食！

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4樓2010-12-21 16:22:41

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rioarsenal

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dhd997(金幣+1):謝謝交流 2010-12-22 08:40:19

引用回帖:

Originally posted by 嘉笛 at 2010-12-21 16:00:24:
請(qǐng)大家?guī)兔聪旅娴囊�，退火溫度�?yīng)該設(shè)為多少？或整個(gè)PCR程序應(yīng)該怎么設(shè)定？目的基因片段全長(zhǎng)705bp，請(qǐng)大家告訴具體數(shù)值或操作步驟，不要寫(xiě)一些公式或軟件，謝謝啦！
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退火溫度60度左右吧，如果想摸條件，做一個(gè)梯度PCR就行了

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5樓2010-12-21 19:07:25

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嘉笛

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silicare(金幣+1):如果你連基本概念都不清楚你覺(jué)得這個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)芡吕^續(xù)嗎，鼓勵(lì)一下新手，還是先學(xué)習(xí)一下教科書(shū)吧 2010-12-22 08:44:18

我學(xué)藥物分析的，開(kāi)始都不知道什么是Tm

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6樓2010-12-22 08:35:19

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xiefl1984

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dhd997(金幣+5): good 2011-02-24 09:10:45
嘉笛(金幣+20): 謝謝 2011-03-01 15:12:35

sense primer
Tm（1M Na+）    75.4
Tm（50mM Na+）    53.8
%GC             40
Anti Primer
Tm（1M Na+）    81
Tm（50mM Na+）    59.4
%GC             42.1
可以參照以上數(shù)據(jù)先做梯度PCR，再進(jìn)一步確定特異性較好的退火溫度
希望對(duì)你有幫助

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7樓2011-02-24 08:38:49

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cyz20050505

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退火溫度有啥好糾結(jié)的，一般的PCR，管你什么引物上去就55讀退火，不行再調(diào)，很多時(shí)間上下浮動(dòng)5度甚至10度都是沒(méi)有好大的區(qū)別。

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8樓2011-02-24 19:34:42

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doubleshen

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二樓好神奇，怎么知道的這么詳細(xì)呀？

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9樓2011-02-24 22:56:53

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