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嘉笛

木蟲(chóng) (小有名氣)

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[交流] 【求助/交流】PCR退火溫度

請(qǐng)大家?guī)兔聪旅娴囊�，退火溫度�?yīng)該設(shè)為多少？或整個(gè)PCR程序應(yīng)該怎么設(shè)定？目的基因片段全長(zhǎng)705bp，請(qǐng)大家告訴具體數(shù)值或操作步驟，不要寫(xiě)一些公式或軟件，謝謝啦！
Sense primers 5’-ATCTCGAGAAAAGAATTGTTGGTGGTTCTG-3’
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PCR退火溫度已經(jīng)有14人回復(fù)

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1樓 2010-12-21 16:00:24

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xiefl1984

木蟲(chóng) (小有名氣)

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★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金幣+5): good 2011-02-24 09:10:45
嘉笛(金幣+20): 謝謝 2011-03-01 15:12:35

sense primer
Tm（1M Na+）    75.4
Tm（50mM Na+）    53.8
%GC             40
Anti Primer
Tm（1M Na+）    81
Tm（50mM Na+）    59.4
%GC             42.1
可以參照以上數(shù)據(jù)先做梯度PCR，再進(jìn)一步確定特異性較好的退火溫度
希望對(duì)你有幫助

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7樓2011-02-24 08:38:49

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feiye2214

木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)

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★ ★ ★
rainwander(金幣+1):呵呵，鼓勵(lì)積極參與~~~ 2010-12-21 19:11:21
silicare(金幣+2):教育意義更精彩 2010-12-22 08:43:10

引用回帖:

Originally posted by 嘉笛 at 2010-12-21 16:00:24:
請(qǐng)大家?guī)兔聪旅娴囊�，退火溫度�?yīng)該設(shè)為多少？或整個(gè)PCR程序應(yīng)該怎么設(shè)定？目的基因片段全長(zhǎng)705bp，請(qǐng)大家告訴具體數(shù)值或操作步驟，不要寫(xiě)一些公式或軟件，謝謝啦！
Sense primers 5’-ATCTCGAGAAAAGAATTGTTG ...

伸手黨

公司給你合成引物的時(shí)候，不是附了合成單了嗎，上面有
一般程序：94 5min 94 30s Tm 30s 72 1min 33cycles 72 10min end
其實(shí)Tm可以做個(gè)梯度試試
多看看文獻(xiàn)吧，不要純伸手啦

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2樓2010-12-21 16:12:04

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yabxxh

木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)

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★ ★ ★
rainwander(金幣+1):鼓勵(lì)積極參與~~~ 2010-12-21 19:11:26
1949stone(金幣+2):很熱心繼續(xù)鼓勵(lì) 2010-12-21 22:45:14

你不想知道為什么要選這些數(shù)值的話，我可以告訴你：
兩條引物的Tm分別為：Sence：61.66，antisence：66.66
反應(yīng)程序：
94 5min
以下5個(gè)循環(huán)
94 30s
56 30s
72 45s
循環(huán)結(jié)束
以下25個(gè)循環(huán)
94 30s
63 30s
72 45s
循環(huán)結(jié)束

72 10min
4 hold

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3樓2010-12-21 16:22:15

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天使托

專(zhuān)家顧問(wèn) (職業(yè)作家)

果然是伸手黨!自己動(dòng)手，豐衣足食！

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4樓2010-12-21 16:22:41

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