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li1977li

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[交流] 【求助/交流】煙曲霉菌提取RNA 已有3人參與

想從煙曲霉中提RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，所在實(shí)驗(yàn)室由于缺乏液氮研磨條件，用的是上海生工的trizol試劑，取約100mg菌體加1ml trizol，用的塑料研磨小棒在冰上磨約10分鐘成勻漿狀再按操作加氯仿等，提了2次在管底均見(jiàn)白色沉淀，濃度為200 ug/ml 左右,260/280為1.9 ，但1%瓊脂糖電泳120V，20min均未看到條帶，請(qǐng)教大家是怎回事？另在無(wú)液氮研磨下如何破壁？液體搖菌在多長(zhǎng)時(shí)間收集菌體？在此先謝了！

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1樓 2011-04-10 20:46:35

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mxlo.o

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8樓: Originally posted by 西瓜 at 2011-11-29 10:31:45:
加異丙醇后的白色沉淀就是RNA啊，沒(méi)有沉淀才不正常。我提RNA，這個(gè)沉淀也是不能完全溶解，雖然最后提的量也不小。之前的帖子里，有人說(shuō)是pH的原因?qū)е虏荒芡耆�，你可以搜搜看�?

這樣啊。我把它當(dāng)成污染離心又除去了，反轉(zhuǎn)錄之后直接擴(kuò)增不出來(lái)。

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9樓2011-11-29 10:40:23

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西瓜

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OD值測(cè)得濃度挺高的了，跑膠看不到條帶十有八九是跑膠過(guò)程中降解了。
可以把電泳槽的緩沖液倒掉，換成新的，再跑一次看看。200ug/ml的濃度，上樣1ul足矣。跑5分鐘就可以看結(jié)果了。需要的話(huà)再跑個(gè)5分鐘就差不多了。
破壁的話(huà)，我們實(shí)驗(yàn)室用的是破碎儀，10多秒就可以搞定。

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2樓2011-04-10 22:01:27

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li1977li

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Originally posted by 西瓜 at 2011-04-10 22:01:27:
OD值測(cè)得濃度挺高的了，跑膠看不到條帶十有八九是跑膠過(guò)程中降解了。
可以把電泳槽的緩沖液倒掉，換成新的，再跑一次看看。200ug/ml的濃度，上樣1ul足矣。跑5分鐘就可以看結(jié)果了。需要的話(huà)再跑個(gè)5分鐘就差不多了 ...

謝謝指導(dǎo)，我都上樣101ul，電泳液是新的但電泳槽沒(méi)經(jīng)處理是跑DNA的，不知有多大影響。

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3樓2011-04-11 08:49:43

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引用回帖:

Originally posted by li1977li at 2011-04-11 08:49:43:
謝謝指導(dǎo)，我都上樣101ul，電泳液是新的但電泳槽沒(méi)經(jīng)處理是跑DNA的，不知有多大影響。

我以前有一次也用的DNA的槽，沒(méi)跑出來(lái)，后來(lái)用新的電泳液洗了一次，再跑就看到了。有條件的話(huà)跑RNA的電泳槽最好專(zhuān)用。
先確定有沒(méi)有RNA吧，跑個(gè)5分鐘就看看，你上10ul都有2ug了，這么大的量，如果有的話(huà)，就算被降解也該看到拖尾的帶的。

提RNA時(shí)，異丙醇沉淀之后看到白色沉淀，我個(gè)人認(rèn)為肯定是提出來(lái)了的。

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4樓2011-04-11 09:11:59

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