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[交流]
【求助/交流】PCR循環(huán)問題
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| 我提取土壤DNA后， PCR建庫， 我用20+40和30+30這兩種循環(huán)次數(shù)，哪個結(jié)果靠譜些？說明原因！謝謝了！ |
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dhd997(金幣+5, EPI+1): good 2011-05-16 08:56:36
dhd997(金幣+5, EPI+1): good 2011-05-16 08:56:36
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(1) 從超低溫冰箱中取出保存樣品 (5 g)； (2) 于室溫融化； (3) 加入13.5 mL CTAB 抽提緩沖液和50 μL 蛋白酶K 貯存液； (4) 離心管于37oC 225 rpm 水平振蕩30 min； (5) 加入1.5 mL20%SDS； (6) 65oC 水浴2 h，每隔15 min 輕輕顛倒數(shù)次； (7) 室溫6,000g 離心10 min，收集上清液，轉(zhuǎn)移至一個新的50 mL 離心管中； (8) 沉淀中再加入4.5 mL 提取液和0.5 mL 20%SDS，輕輕渦旋至混勻； (9) 浸入液氮中冷凍3 min 后，于沸水中煮沸3 min； (10) 室溫6,000g 離心10 min，收集上清液，與上次上清液合并； (11) 重復(fù)(8)、(9)、(10)一次； (12) 將三次提取所獲上清液與等體積的苯酚：氯仿(1:1 v/v) 混合，搖勻后于4 oC 12,000g 離心10 min； (13) 將上層水相轉(zhuǎn)移至一新的50 mL 離心管中，加入等體積的氯仿：異戊醇(24:1)， 混勻后于4 oC 12,000g 離心10 min； (14) 再次轉(zhuǎn)移上清至一新的離心管中，加入0.6 倍體積的異丙醇于室溫沉淀1 h； (15) 室溫12,000g 離心20 min； (16) 收集沉淀，用預(yù)冷的70%乙醇洗滌沉淀； (17) 向離心管中加入1 mL TE，于4 oC 放置過夜，分裝保存于‐20 oC。 |
8樓2011-05-15 11:01:01
天使托
專家顧問 (職業(yè)作家)
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2樓2011-04-11 11:40:04
zhaohq1209
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3樓2011-04-11 12:41:48
4樓2011-04-11 13:10:27
簡單回復(fù)
ureyguo12樓
2011-05-16 21:33
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