 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 5 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 5378 | 回復(fù): 15 | |||||||
| 【獎(jiǎng)勵(lì)】 本帖被評價(jià)14次，作者空谷幽風(fēng)增加金幣 10.8 個(gè) | |||||||
| 當(dāng)前只顯示滿足指定條件的回帖，點(diǎn)擊這里查看本話題的所有回帖 | |||||||
空谷幽風(fēng)金蟲 (正式寫手)
|
[資源]
【分享】分子克隆實(shí)驗(yàn)專題-（二）酶切連接要點(diǎn)探討
|
||||||
|
分子克隆實(shí)驗(yàn)專題-（二）酶切連接要點(diǎn)探討 聲明：關(guān)于酶切連接的實(shí)驗(yàn)做法我在之前的帖子里已經(jīng)非常詳細(xì)的介紹了，原帖鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=2311683 我們在這里對相關(guān)問題進(jìn)行探討 1. 酶切 （1） PCR產(chǎn)物的酶切 ①酶切位點(diǎn)兩端要有適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)堿基。一般在設(shè)計(jì)引物的時(shí)候會(huì)在新添加的酶切位點(diǎn)前加4-5個(gè)堿基當(dāng)做保護(hù)堿基，這種保護(hù)堿基的序列沒有特殊的要求，不要添加完后使你的引物不能用就行了（好引物應(yīng)該具備的條件大家應(yīng)該都知道吧） – NEB http://www.nebchina.com/cn/tech/re/cleavage_olig.htm – TaKaRa PCR產(chǎn)物末端限制酶切位點(diǎn)的切段情況 ②在保證不產(chǎn)生星號活性的情況下，適當(dāng)延長酶切時(shí)間，但要注意核酸酶的污染。曾經(jīng)用過fermentas的某種快切酶，切完后竟然會(huì)在酶切位點(diǎn)處多切掉1個(gè)堿基。 （2） 質(zhì)粒DNA的酶切 ①不要選用臨近的或交叉的酶切位點(diǎn) 如XbaI / BamHI/ SmaI TCTAGA GGATCCCGGG ②小心容易甲基化的酶切位點(diǎn)，如XbaI。這種情況下我們一般會(huì)把質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)一下甲基化修飾缺陷的感受態(tài)細(xì)胞，比如JM110(關(guān)于感受態(tài)細(xì)胞的選擇我會(huì)專門開一個(gè)專題單獨(dú)介紹) 2.影響酶切效果的因素 雙酶切反應(yīng)體系 • TaKaRa: • Double Digestion 時(shí)的Universal Buffer的使用表 • NEB: • http://www.neb.com/nebecomm/DoubleDigestCalculator.asp • MBI： • http://www.fermentas.com/doubledigest/index.html • 分步酶切順序的選擇：選擇適當(dāng)?shù)拿盖许樞?低鹽 -----高鹽） 甲基化位點(diǎn)的影響 • 設(shè)計(jì)方案時(shí)盡量避免使用 • JM110 • PCR 擴(kuò)增后再切 質(zhì)粒DNA的質(zhì)量與定量 • 質(zhì)量：抽提過程中雜質(zhì)的殘留 • 定量：分步酶切時(shí),酶切足夠的DNA,保證第二步回收到濃度較高的載體或片段 酶切不完全 • 公用buffer選擇不當(dāng) • 質(zhì)粒DNA量過多 • 酶的活性不高 酶切出的小片段回收效率低 • PCR擴(kuò)增后再酶切 • 回收上柱時(shí)加終濃度為20%的異丙醇 • Glass beads (> 40 bp) 3.影響連接的因素 （1） 片段的質(zhì)量 片段回收時(shí)紫外線照射對克隆效率的影響 （2）摩爾比 In general, maximum cloning efficiency is achieved when using a 2:1 molar ratio of insert: vector. |
回復(fù)此樓» 收錄本帖的淘帖專輯推薦
 分子實(shí)驗(yàn)常見問題 | 有價(jià)值的生物經(jīng)驗(yàn)貼 | Enjoy my life！ | 好帖 |
| 核酸方面 |
» 猜你喜歡
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之小鼠實(shí)驗(yàn)：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計(jì)，解析生命機(jī)制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之重金屬檢測：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有114人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
留學(xué)--博士招生
已經(jīng)有16人回復(fù)
-
化學(xué)工程，本211，求調(diào)劑，ab區(qū)不限
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
邵陽學(xué)院食品與化學(xué)工程學(xué)院碩士調(diào)劑
已經(jīng)有0人回復(fù)
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
» 本主題相關(guān)價(jià)值貼推薦，對您同樣有幫助:
- 基因克隆中酶切連接問題
已經(jīng)有13人回復(fù)
- 做酶切連接后轉(zhuǎn)化再提質(zhì)粒，質(zhì)粒明顯變小，Why???
已經(jīng)有24人回復(fù)
- 單酶切連接的問題
已經(jīng)有4人回復(fù)
- DNA雙酶切后在兩端加adapter的連接問題
已經(jīng)有7人回復(fù)
- 連接酶切問題
已經(jīng)有10人回復(fù)
- 將質(zhì)粒上緊挨著的兩個(gè)酶切位點(diǎn)進(jìn)行雙酶切后連接外源基因片段，是不是不好連接？
已經(jīng)有13人回復(fù)
- PCR ， 雙酶切，連接問題
已經(jīng)有17人回復(fù)
- 分子克隆連接問題！
已經(jīng)有12人回復(fù)
- 雙酶切連接表達(dá)載體，兩個(gè)月都沒做出來，問題到底出在哪里呢~？求指點(diǎn)
已經(jīng)有52人回復(fù)
- 為什么我做的酶切連接總是不長斑呢？
已經(jīng)有24人回復(fù)
- 【專題】分子克隆實(shí)驗(yàn)專題--（五）感受態(tài)細(xì)胞的選擇與使用
已經(jīng)有15人回復(fù)
- 【求助/交流】質(zhì)粒雙酶切連接問題
已經(jīng)有7人回復(fù)
- 【求助/交流】關(guān)于酶切產(chǎn)物連接的一點(diǎn)問題
已經(jīng)有13人回復(fù)
1949stone
榮譽(yù)版主 (知名作家)
- MolEPI: 4
- 應(yīng)助: 95 (初中生)
- 貴賓: 2.38
- 金幣: 2633.7
- 帖子: 9831
- 在線: 2692.8小時(shí)
- 蟲號: 765987
3樓2011-04-12 17:04:21
西瓜
榮譽(yù)版主 (知名作家)
- MolEPI: 50
- 應(yīng)助: 94 (初中生)
- 貴賓: 3.157
- 金幣: 1849.6
- 帖子: 7553
- 在線: 1449.5小時(shí)
- 蟲號: 271749
2樓2011-04-12 11:05:10
5樓2011-04-14 10:11:35
6樓2011-04-14 10:46:18
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 學(xué)碩274求調(diào)劑 +9 | Li李魚 2026-03-26 | 9/450 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 085600，專業(yè)課化工原理，321分求調(diào)劑 +3 | 大饞小子 2026-03-28 | 3/150 |
|
|
[考研] 321求調(diào)劑 +6 | 璞玉~~ 2026-03-25 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 一志愿北京工業(yè)大學(xué)，324分求調(diào)劑 +4 | 零八# 2026-03-28 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 0703本科鄭州大學(xué)求調(diào)劑 +3 | nhj_ 2026-03-25 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 材料與化工（0856）304求B區(qū)調(diào)劑 +8 | 邱gl 2026-03-27 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 0856，材料與化工321分求調(diào)劑 +12 | 大饞小子 2026-03-27 | 13/650 |
|
|
|
[考研] 材料求調(diào)劑一志愿哈工大324 +7 | 閆旭東 2026-03-28 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 279 分 求調(diào)劑 +4 | 睡個(gè)好覺_16 2026-03-24 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 312求調(diào)劑 +9 | 上岸吧ZJY 2026-03-22 | 13/650 |
|
|
|
[考研] 314求調(diào)劑 +3 | 溪云珂 2026-03-26 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑 一志愿 本科 北科大 化學(xué) 343 +6 | 13831862839 2026-03-24 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 340求調(diào)劑 +3 | Amber00 2026-03-26 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 一志愿天津大學(xué)339材料與化工求調(diào)劑 +3 | 江往賣魚 2026-03-26 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 290分調(diào)劑求助 +3 | 吉祥止止陳 2026-03-25 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 0854人工智能方向招收調(diào)劑 +4 | 章小魚567 2026-03-24 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 284求調(diào)劑 +15 | Zhao anqi 2026-03-22 | 15/750 |
|
|
|
[考研] 344求調(diào)劑 +3 | desto 2026-03-24 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 一志愿國科過程所081700，274求調(diào)劑 +3 | 三水研0水立方 2026-03-23 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 石河子大學(xué)（211、雙一流）碩博研究生長期招生公告 +3 | 李子目 2026-03-22 | 3/150 |
|