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【分享】分子克隆實驗專題-（二）酶切連接要點探討
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分子克隆實驗專題-（二）酶切連接要點探討 聲明：關于酶切連接的實驗做法我在之前的帖子里已經(jīng)非常詳細的介紹了，原帖鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=2311683 我們在這里對相關問題進行探討 1. 酶切 （1） PCR產(chǎn)物的酶切 ①酶切位點兩端要有適當?shù)谋Ｗo堿基。一般在設計引物的時候會在新添加的酶切位點前加4-5個堿基當做保護堿基，這種保護堿基的序列沒有特殊的要求，不要添加完后使你的引物不能用就行了（好引物應該具備的條件大家應該都知道吧） – NEB http://www.nebchina.com/cn/tech/re/cleavage_olig.htm – TaKaRa PCR產(chǎn)物末端限制酶切位點的切段情況 ②在保證不產(chǎn)生星號活性的情況下，適當延長酶切時間，但要注意核酸酶的污染。曾經(jīng)用過fermentas的某種快切酶，切完后竟然會在酶切位點處多切掉1個堿基。 （2） 質(zhì)粒DNA的酶切 ①不要選用臨近的或交叉的酶切位點 如XbaI / BamHI/ SmaI TCTAGA GGATCCCGGG ②小心容易甲基化的酶切位點，如XbaI。這種情況下我們一般會把質(zhì)粒重新轉一下甲基化修飾缺陷的感受態(tài)細胞，比如JM110(關于感受態(tài)細胞的選擇我會專門開一個專題單獨介紹) 2.影響酶切效果的因素 雙酶切反應體系 • TaKaRa: • Double Digestion 時的Universal Buffer的使用表 • NEB: • http://www.neb.com/nebecomm/DoubleDigestCalculator.asp • MBI： • http://www.fermentas.com/doubledigest/index.html • 分步酶切順序的選擇：選擇適當?shù)拿盖许樞?低鹽 -----高鹽） 甲基化位點的影響 • 設計方案時盡量避免使用 • JM110 • PCR 擴增后再切 質(zhì)粒DNA的質(zhì)量與定量 • 質(zhì)量：抽提過程中雜質(zhì)的殘留 • 定量：分步酶切時,酶切足夠的DNA,保證第二步回收到濃度較高的載體或片段 酶切不完全 • 公用buffer選擇不當 • 質(zhì)粒DNA量過多 • 酶的活性不高 酶切出的小片段回收效率低 • PCR擴增后再酶切 • 回收上柱時加終濃度為20%的異丙醇 • Glass beads (> 40 bp) 3.影響連接的因素 （1） 片段的質(zhì)量 片段回收時紫外線照射對克隆效率的影響 （2）摩爾比 In general, maximum cloning efficiency is achieved when using a 2:1 molar ratio of insert: vector. |
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2樓2011-04-12 11:05:10
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