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【分享】分子克隆實(shí)驗(yàn)專(zhuān)題-（二）酶切連接要點(diǎn)探討
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分子克隆實(shí)驗(yàn)專(zhuān)題-（二）酶切連接要點(diǎn)探討 聲明：關(guān)于酶切連接的實(shí)驗(yàn)做法我在之前的帖子里已經(jīng)非常詳細(xì)的介紹了，原帖鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=2311683 我們?cè)谶@里對(duì)相關(guān)問(wèn)題進(jìn)行探討 1. 酶切 （1） PCR產(chǎn)物的酶切 ①酶切位點(diǎn)兩端要有適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)堿基。一般在設(shè)計(jì)引物的時(shí)候會(huì)在新添加的酶切位點(diǎn)前加4-5個(gè)堿基當(dāng)做保護(hù)堿基，這種保護(hù)堿基的序列沒(méi)有特殊的要求，不要添加完后使你的引物不能用就行了（好引物應(yīng)該具備的條件大家應(yīng)該都知道吧） – NEB http://www.nebchina.com/cn/tech/re/cleavage_olig.htm – TaKaRa PCR產(chǎn)物末端限制酶切位點(diǎn)的切段情況 ②在保證不產(chǎn)生星號(hào)活性的情況下，適當(dāng)延長(zhǎng)酶切時(shí)間，但要注意核酸酶的污染。曾經(jīng)用過(guò)fermentas的某種快切酶，切完后竟然會(huì)在酶切位點(diǎn)處多切掉1個(gè)堿基。 （2） 質(zhì)粒DNA的酶切 ①不要選用臨近的或交叉的酶切位點(diǎn) 如XbaI / BamHI/ SmaI TCTAGA GGATCCCGGG ②小心容易甲基化的酶切位點(diǎn)，如XbaI。這種情況下我們一般會(huì)把質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)一下甲基化修飾缺陷的感受態(tài)細(xì)胞，比如JM110(關(guān)于感受態(tài)細(xì)胞的選擇我會(huì)專(zhuān)門(mén)開(kāi)一個(gè)專(zhuān)題單獨(dú)介紹) 2.影響酶切效果的因素 雙酶切反應(yīng)體系 • TaKaRa: • Double Digestion 時(shí)的Universal Buffer的使用表 • NEB: • http://www.neb.com/nebecomm/DoubleDigestCalculator.asp • MBI： • http://www.fermentas.com/doubledigest/index.html • 分步酶切順序的選擇：選擇適當(dāng)?shù)拿盖许樞?低鹽 -----高鹽） 甲基化位點(diǎn)的影響 • 設(shè)計(jì)方案時(shí)盡量避免使用 • JM110 • PCR 擴(kuò)增后再切 質(zhì)粒DNA的質(zhì)量與定量 • 質(zhì)量：抽提過(guò)程中雜質(zhì)的殘留 • 定量：分步酶切時(shí),酶切足夠的DNA,保證第二步回收到濃度較高的載體或片段 酶切不完全 • 公用buffer選擇不當(dāng) • 質(zhì)粒DNA量過(guò)多 • 酶的活性不高 酶切出的小片段回收效率低 • PCR擴(kuò)增后再酶切 • 回收上柱時(shí)加終濃度為20%的異丙醇 • Glass beads (> 40 bp) 3.影響連接的因素 （1） 片段的質(zhì)量 片段回收時(shí)紫外線照射對(duì)克隆效率的影響 （2）摩爾比 In general, maximum cloning efficiency is achieved when using a 2:1 molar ratio of insert: vector. |
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 分子實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題 | 有價(jià)值的生物經(jīng)驗(yàn)貼 | Enjoy my life！ | 好帖 |
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7樓2011-04-14 11:10:13
西瓜
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2樓2011-04-12 11:05:10
1949stone
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3樓2011-04-12 17:04:21
5樓2011-04-14 10:11:35
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