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tutufei

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我想做反轉(zhuǎn)錄，然后擴(kuò)增目的條帶，不知道RNA提得可以嗎？第一個(gè)泳道不知道為什么跟其他的不一樣？

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1樓 2011-04-17 22:32:22

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西瓜

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scelab(金幣+9, EPI+1): 很好很強(qiáng)大 2011-04-23 18:09:57
tutufei(金幣+5): 謝謝，不好意思我的電泳最上面的條帶才是最小的，不是DNA，可是就算少量DNA污染，還是會(huì)擴(kuò)增出目的條帶啊，那不就影響結(jié)果了嗎？ 2011-04-23 21:55:56

引用回帖:

Originally posted by tutufei at 2011-04-17 22:32:22:
我想做反轉(zhuǎn)錄，然后擴(kuò)增目的條帶，不知道RNA提得可以嗎？第一個(gè)泳道不知道為什么跟其他的不一樣？

關(guān)于你提的RNA的質(zhì)量：
1.頂上的亮帶是基因組DNA。如果是Trizol法提的，那就可能是抽提之后取上清時(shí)取得太多，吸到了中間相。以后這一步不用貪多的。
如果是檢測(cè)表達(dá)量差異，那么基因組DNA混在cDNA里面，會(huì)干擾結(jié)果。如此多的基因組DNA污染，不能拿來(lái)定量。
所幸，你的目的只是拿來(lái)擴(kuò)增目的條帶，那這個(gè)沒(méi)關(guān)系，你的RNA可以用

2.RNA量質(zhì)量可以從中間兩條rRNA的帶看出來(lái)，你這兩條帶都有點(diǎn)拖尾，RNA有部分降解，第一個(gè)泳道最嚴(yán)重。
3.第一個(gè)泳道出現(xiàn)彌散狀，中間兩條rRNA的亮帶都看不到，是很典型的RNA降解。
4.關(guān)于兩條rRNA帶亮度的差異，兩倍是理論值，實(shí)際上往往不是這樣，不用強(qiáng)求啦。

關(guān)于反轉(zhuǎn)錄引物的選擇：
反轉(zhuǎn)錄可分為兩種，一種是反轉(zhuǎn)錄出總的cDNA,另一種是只反轉(zhuǎn)錄你所需的目的基因的cDNA。
1.反轉(zhuǎn)錄出總的cDNA：有兩種通用引物，一種是隨機(jī)寡肽，它可以結(jié)合到隨機(jī)位點(diǎn)，并且它的5‘端和3’端都有羥基，都可以介導(dǎo)反轉(zhuǎn)錄；另一種是Oligo dT，可以和mRNA的Poly A尾巴結(jié)合，但不能介導(dǎo)其他RNA的反轉(zhuǎn)錄。Takara的試劑盒同時(shí)提供兩種引物，并建議兩種引物一起用。我覺(jué)得如果都有的話，最好一起用。
2.反轉(zhuǎn)錄出目的基因的cDNA：這個(gè)只能設(shè)計(jì)特異的引物了。跟PCR引物設(shè)計(jì)類似。

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9樓2011-04-23 18:04:13

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wolfebst(金幣+1): 鼓勵(lì)多多交流 2011-04-18 08:11:57

引用回帖:

不知lz提取的是什么東東的RNA？

我提過(guò)細(xì)菌的total RNA。從lz的電泳圖來(lái)看，質(zhì)量不好。RIN值太低，表明降解嚴(yán)重。

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2樓2011-04-18 06:48:11

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rainwander(金幣+1, EPI+1): 相應(yīng)管理員號(hào)召，開(kāi)始加大EPI給予力度~ 2011-04-18 13:22:07

提取的大腸桿菌total RNA，可以用來(lái)做轉(zhuǎn)錄組分析的。大條帶應(yīng)該是小條帶亮度的兩倍最好，最差也得亮度差不多，對(duì)應(yīng)的數(shù)量差不多。

祝lz實(shí)驗(yàn)順利！

[ Last edited by zhaohq1209 on 2011-4-18 at 09:31 ]

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3樓2011-04-18 09:30:10

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引用回帖:

Originally posted by zhaohq1209 at 2011-04-18 06:48:11:
不知lz提取的是什么東東的RNA？

我提過(guò)細(xì)菌的total RNA。從lz的電泳圖來(lái)看，質(zhì)量不好。RIN值太低，表明降解嚴(yán)重。

提的就是細(xì)菌的total RNA，沒(méi)辦法，實(shí)驗(yàn)室沒(méi)做過(guò)RNA，所以條件不好，這個(gè)電泳沒(méi)加變性劑

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4樓2011-04-18 13:17:02

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