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tutufei

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我想做反轉(zhuǎn)錄，然后擴增目的條帶，不知道RNA提得可以嗎？第一個泳道不知道為什么跟其他的不一樣？

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1樓 2011-04-17 22:32:22

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tutufei

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Originally posted by 西瓜 at 2011-04-23 22:05:03:

囧
擴增目的條帶的話，如果有基因組DNA的擴增，那大小會和cDNA擴增產(chǎn)物不一樣的，后續(xù)可以通過膠回收得到想要的產(chǎn)物。當(dāng)然如果內(nèi)含子很小，可能在膠上看不出來。

我提的是細(xì)菌RNA，沒有內(nèi)含子吧

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11樓2011-04-23 22:07:33

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zhaohq1209

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wolfebst(金幣+1): 鼓勵多多交流 2011-04-18 08:11:57

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Originally posted by tutufei at 2011-04-17 22:32:22:
我想做反轉(zhuǎn)錄，然后擴增目的條帶，不知道RNA提得可以嗎？第一個泳道不知道為什么跟其他的不一樣？

不知lz提取的是什么東東的RNA？

我提過細(xì)菌的total RNA。從lz的電泳圖來看，質(zhì)量不好。RIN值太低，表明降解嚴(yán)重。

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2樓2011-04-18 06:48:11

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zhaohq1209

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rainwander(金幣+1, EPI+1): 相應(yīng)管理員號召，開始加大EPI給予力度~ 2011-04-18 13:22:07

提取的大腸桿菌total RNA，可以用來做轉(zhuǎn)錄組分析的。大條帶應(yīng)該是小條帶亮度的兩倍最好，最差也得亮度差不多，對應(yīng)的數(shù)量差不多。

祝lz實驗順利！

[ Last edited by zhaohq1209 on 2011-4-18 at 09:31 ]

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3樓2011-04-18 09:30:10

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Originally posted by zhaohq1209 at 2011-04-18 06:48:11:
不知lz提取的是什么東東的RNA？

我提過細(xì)菌的total RNA。從lz的電泳圖來看，質(zhì)量不好。RIN值太低，表明降解嚴(yán)重。

提的就是細(xì)菌的total RNA，沒辦法，實驗室沒做過RNA，所以條件不好，這個電泳沒加變性劑

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4樓2011-04-18 13:17:02

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zhaohq1209

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wolfebst(EPI+1): 回答不錯 2011-04-18 14:36:44
tutufei(金幣+5): 謝謝你的建議！ 2011-04-23 00:04:47

引用回帖:

Originally posted by tutufei at 2011-04-18 13:17:02:
提的就是細(xì)菌的total RNA，沒辦法，實驗室沒做過RNA，所以條件不好，這個電泳沒加變性劑

其實提取RNA的條件沒那么苛刻，在普通的通風(fēng)櫥里就可以操作，外源RNase的污染比較好消除，關(guān)鍵是破壁時的內(nèi)源降解。如果用trizol法就必須考慮trizol的量。

另外，相同的方法提取不同細(xì)菌的RNA效果也不一樣。比如霍亂用trizol法提取效果極差，而沙門菌提取效果就較好；所以霍亂菌最好是用試劑盒過柱子提取，然后濃縮。我提取的是大腸桿菌，摸索了好幾種方法，最后確定也是qiagen 的kit提取，然后濃縮。

另外，有一種可以噴的液體，叫做RNase抑制劑，用于消除表面RNase的污染，在客觀條件不是很好的時候很有效。

最后祝lz實驗順利，好運啊！

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5樓2011-04-18 14:25:16

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wang7x7x

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你的樣品可能有基因組污染，跑個MOPS電泳看看吧，還可以看看純度指標(biāo)，檢測下260與280的比值。

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6樓2011-04-18 17:57:03

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tutufei

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Originally posted by zhaohq1209 at 2011-04-18 14:25:16:
其實提取RNA的條件沒那么苛刻，在普通的通風(fēng)櫥里就可以操作，外源RNase的污染比較好消除，關(guān)鍵是破壁時的內(nèi)源降解。如果用trizol法就必須考慮trizol的量。

另外，相同的方法提取不同細(xì)菌的RNA效果也不一樣。 ...

再請教個問題，細(xì)菌RNA做反轉(zhuǎn)錄時，引物怎么選擇，是選隨機引物嗎

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7樓2011-04-23 00:06:38

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zhaohq1209

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Originally posted by tutufei at 2011-04-23 00:06:38:
再請教個問題，細(xì)菌RNA做反轉(zhuǎn)錄時，引物怎么選擇，是選隨機引物嗎

可以用隨機引物將RNA翻轉(zhuǎn)成cDNA；也可以用特異引物直接翻轉(zhuǎn)特異的片段。

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8樓2011-04-23 15:38:37

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西瓜

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scelab(金幣+9, EPI+1): 很好很強大 2011-04-23 18:09:57
tutufei(金幣+5): 謝謝，不好意思我的電泳最上面的條帶才是最小的，不是DNA，可是就算少量DNA污染，還是會擴增出目的條帶啊，那不就影響結(jié)果了嗎？ 2011-04-23 21:55:56

引用回帖:

Originally posted by tutufei at 2011-04-17 22:32:22:
我想做反轉(zhuǎn)錄，然后擴增目的條帶，不知道RNA提得可以嗎？第一個泳道不知道為什么跟其他的不一樣？

關(guān)于你提的RNA的質(zhì)量：
1.頂上的亮帶是基因組DNA。如果是Trizol法提的，那就可能是抽提之后取上清時取得太多，吸到了中間相。以后這一步不用貪多的。
如果是檢測表達(dá)量差異，那么基因組DNA混在cDNA里面，會干擾結(jié)果。如此多的基因組DNA污染，不能拿來定量。
所幸，你的目的只是拿來擴增目的條帶，那這個沒關(guān)系，你的RNA可以用

2.RNA量質(zhì)量可以從中間兩條rRNA的帶看出來，你這兩條帶都有點拖尾，RNA有部分降解，第一個泳道最嚴(yán)重。
3.第一個泳道出現(xiàn)彌散狀，中間兩條rRNA的亮帶都看不到，是很典型的RNA降解。
4.關(guān)于兩條rRNA帶亮度的差異，兩倍是理論值，實際上往往不是這樣，不用強求啦。

關(guān)于反轉(zhuǎn)錄引物的選擇：
反轉(zhuǎn)錄可分為兩種，一種是反轉(zhuǎn)錄出總的cDNA,另一種是只反轉(zhuǎn)錄你所需的目的基因的cDNA。
1.反轉(zhuǎn)錄出總的cDNA：有兩種通用引物，一種是隨機寡肽，它可以結(jié)合到隨機位點，并且它的5‘端和3’端都有羥基，都可以介導(dǎo)反轉(zhuǎn)錄；另一種是Oligo dT，可以和mRNA的Poly A尾巴結(jié)合，但不能介導(dǎo)其他RNA的反轉(zhuǎn)錄。Takara的試劑盒同時提供兩種引物，并建議兩種引物一起用。我覺得如果都有的話，最好一起用。
2.反轉(zhuǎn)錄出目的基因的cDNA：這個只能設(shè)計特異的引物了。跟PCR引物設(shè)計類似。

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9樓2011-04-23 18:04:13

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西瓜

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10樓2011-04-23 22:05:03

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Originally posted by tutufei at 2011-04-23 22:07:33:
我提的是細(xì)菌RNA，沒有內(nèi)含子吧

那其實可以直接用基因組DNA擴增目的片段呀，為什么要提RNA再反轉(zhuǎn)錄呢？

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12樓2011-04-23 22:13:39

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