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怎P不出來呢？求解！
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| 準(zhǔn)備克隆表達(dá)一蛋白，從煙曲霉中提RNA反轉(zhuǎn)錄后先做梯度PCR（10ul-10管）得出最佳退火溫度為60度，接下來想做膠回收卻怎么也P不出來目的基因了（1.3kbp),用的是相同的試劑、條件，50ul,100ul體系，50ul分成5管，100ul分成10管最后混合跑電泳都失敗，糾結(jié)啊盼請高手分析原因，謝謝！附梯度條件：94° 1min,94° 5s,60-70°90s,72° 90s,35cycles,72° 10min.用的是Taq酶PCR Green Mix。 |
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yuxia82012
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2樓2011-04-20 16:23:34
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yuxia82012
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5樓2011-04-20 17:10:05
yuxia82012
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6樓2011-04-20 17:41:05
7樓2011-04-20 19:26:03
yuxia82012
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8樓2011-04-20 19:30:54
roomofxw
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【答案】應(yīng)助回帖
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amisking(金幣+1, EPI+1): 鼓勵發(fā)帖應(yīng)助。 2011-04-20 20:43:37
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1.請驗(yàn)證模板是否OK 2.能否重復(fù)梯度PCR結(jié)果，包括PCR孔也要驗(yàn)證哦 3.是否是一管酶快用完了，剩下的活性不好了，或者不是同一批次的，可以做陽性對照 4.60-70度的梯度，確定是60度最佳，不科學(xué)啊，怎知降五度就不好呢？ 5.應(yīng)該保留梯度PCR產(chǎn)物，可以作為模板二次PCR；或者做陽性對照 重點(diǎn)檢查模板，以及降低退火溫度，不建議tag，保真性不好 說不定你梯度的那個孔在最邊緣，設(shè)的六十度，實(shí)際只有58度…… |
9樓2011-04-20 19:43:53
roomofxw
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【答案】應(yīng)助回帖
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amisking(金幣+2): 鼓勵發(fā)帖應(yīng)助。 2011-04-20 20:43:49
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O(∩_∩)O哈！ 不知道大家的實(shí)驗(yàn)材料保存多久？ 我記得我一次從基因組里面釣基因出來，PCR出來了，送產(chǎn)物直接去測序了。 結(jié)果后面再做好幾次，都沒有出來 一怒讓測序公司把那管子送回來，加了點(diǎn)水涮涮，取出來當(dāng)模板，哈哈，OK 所以以后每次PCR產(chǎn)物，都盡量保存的。 當(dāng)然酶最好用保真性好的，不然二次PCR就增加了突變的可能  |
10樓2011-04-20 19:53:17
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